МЕМБРАН
В настоящее время с помощью всех новых методов исследования структуры биологических объектов установлено, что огромное значение в создании структуры клеток имеют мембраны (см. рис. 19). Мембраны окружают всю цитоплазму и отграничивают ее от окружающей среды. Проникновение веществ в клетку и из клетки в большой степени зависит от свойств мембраны. Как отметил Д. Бернал, «только после образования мембра ны вокруг всей клетки мы действительно имеем то, что с полным правом может быть названо организмом». Кроме того, мембраны образуют оболочки всех органоидов и включений клетки: ядра, митохондрий, лизосом, аппарата Гольджи, эндоплазматического ретикулума.
124
Теории молекулярного строения клеточной мембраны вначале базировались на косвенных данных. Раньше ученые считали, что мембраны состоят только из липидов. Так, Овертон на основании того, что вещества, растворимые в липидах, легко проникают через клеточную мембрану, выдвинул в 1902 г. предположение, что она состоит из тонкого слоя липидов.
Свойства и химический состав мембраны часто изучаются на оболочках эритроцитов. Оболочки эритроцитов представляют собой мембраны, которые очень легко получить путем гемолиза эритроцитов в гипотоническом растворе. В 1925 г. Гортер и Грендел в довольно простых опытах с липидами, экстрагированными из мембран эритроцитов, обнаружили, что площадь монослоя, занимаемого липидами, вдвое больше суммарной площади поверхности всех эритроцитов. Был сделан вывод, что липиды мембран расположены в виде бимолекулярного слоя. Эта теория подкреплялась данными, полученными при измерении электрических параметров клетки, которые свидетельствовали о высоком сопротивлении клеточной мембраны (порядка 1000 Ом/см2). Столь высокое сопротивление характерно для липидов, обладающих малой проводимостью.
Однако многие данные свидетельствовали также о наличии в клеточной мембране белковых молекул. Например, такие свойства мембран, как растяжимость, эластичность и способность некоторых из них к сокращению, можно объяснить лишь наличием вмембране белков, причем фибриллярных белков. Кроме того, при
измерении поверхностного натяжения крупных клеток, например яиц морского ежа, было установлено, что поверхностное натяжение клеток сильно отличается от поверхностного натяжения липидов. Было предположено, что низкое поверхностное натяжение клеточной мембраны обусловлено наличием белковых слоев, покрывающих липидные компоненты мембран. И действительно, добавление к модельной липидно-водной системе небольшого количества белка заметно снижает ее поверхностное натяжение.
На основе анализа приведенных данных Даниэлли и Давсон в 1935 г. предложили модель строения мембраны, которая не претерпела существенных изменений до нашего времени. Согласно этой модели (рис. 21), имеются два слоя молекул фосфолипидов, которые распо-
125
молекула липида |
молекула белка |
ложены перпендикулярно поверхности мембраны. Гидрофильными концами молекулы липидов направлены наружу, а гидрофобными — к центру мембраны. Гидрофобные концы — это такие концы,
Полярная пора |
Рис. 21. Схема строения клеточной мембраны по Даниэлли и Давсону. |
которые не содержат полярных групп и не могут присоединять молекулы воды. Обычно гидрофобный конец молекулы представлен насыщенной углеводородной цепью органической кислоты.
Гидрофильные концы молекул фосфолипидов содержат полярные группы, которые способны взаимодействовать с дипольными молекулами воды и формировать гидратные оболочки.
На полярных группах молекул фосфолипидов мембраны адсорбированы белковые цепочки, которые в форме глобул покрывают двойной слой фосфолипидов с обеих сторон, придавая ему тем самым известную эластичность и устойчивость к механическим повреждениям, а также низкое поверхностное натяжение. Полярные группы молекул глобулярных белков направлены наружу — в сторону водной фазы, а неполярные группы — в сторону липидов.
К полярным группам относятся аминная, карбоксильная, фосфатная, гидроксильная, карбонильная и некоторые другие.
Поскольку длина липидных молекул равна примерно 3 нм. а толщина монослоя белка не превышает 1 нм, то толщина клеточной мембраны оценивалась примерно в 8 нм.
При этом считалось, что на одну молекулу белка приходится приблизительно 75 — 90 молекул липидов.
Последующие электронномикроскопические исследования подтвердили правильность этой модели. При исследовании ультраструктуры миелина Дж. Робертсоном в
126
Рис. 22. Схема строения элементарной мембраны.
А — по Дж. Робертсону (1059); Б — современная модель (по Л. Хокину и
М. Хокиной, 1967).
1959 г. была выдвинута теория ординарной или унитарной мембраны. По его мнению, основной единицей всех мембранных структур клеток является трехслойная структура толщиной 7,5 — 9 нм. Эта элементарная мембрана состоит из одного бимолекулярного слоя фосфолипидов, покрытого с цитоплазматическои стороны слоем фибриллярного белка, а с наружной поверхности — мукополисахаридами или мукопротеидами (рис. 22, А).
В настоящее время большинство ученых придерживается следующего представления о структуре мембран: двойной слой фосфолипидов расположен между двумя тонкими слоями молекул фибриллярного белка, которые в свою очередь окружены молекулами глобулярных белков (рис. 22, Б). Белки, входящие в состав мембран, составляют 70 — 75% ее веса (по Гельману) и разделяются на структурные белки, не обладающие ферментативной активностью, и каталитические белки, которые обладают ферментативной активностью.
Способность структурного белка к построению мембран, по мнению Ю. А. Владимирова и Г. И. Клебанова, обусловлена тремя его свойствами: 1) способностью давать комплексы с липидами; 2) способностью стехио-
127
метрически взаимодействовать с другими белками1; 3) способностью к агрегации, которая проявляется в образовании кристаллов, а вместе с фосфолипидами — в участии при образовании мембран.
В настоящее время в литературе широко обсуждается вопрос о природе сил, связывающих мембранные белки и формирующих мембраны. На основе изучения процессов агрегации структурного белка в зависимости от рН среды, ионной силы раствора и других факторов вышеназванные авторы пришли к выводу, что агрегация обусловлена гидрофобными взаимодействиями, скрепляющими субъединицы белка.
В настоящее время большой интерес исследователей вызывает изучение конформации белков мембран. В литературе высказывается предположение, что многие жизненно важные процессы, такие, как окислительное фосфорилирование, активный транспорт веществ, химические реакции при фотосинтезе, проведение нервного импульса, движение цитоплазмы и др., сопровождаются, а может быть, и вызываются изменением способа укладки полипептидной цепи, т. е. изменением конформации белковых молекул в мембранах. Так, в опытах Кеннеди (1967) показано, что активный транспорт некоторых веществ (аминокислот и Сахаров) определяется изменением конформации специфических белков — переносчиков, вмонтированных в мембрану. В связи с этим проводятся очень интенсивные исследования конформации белковых молекул мембран.
При этом применяются методы люминесцентного анализа, инфракрасной спектроскопии, измерения оптической активности и др.
Вторым химическим компонентом мембран являются липиды, составляющие от 20 до 30% их сухого веса. Наибольшая часть липидов представляет собой фосфолипиды, количество которых, например, в митохондриях может достигать 90% от содержания всех липидов. Наиболее распространен в биологических мембранах фосфотидилхолин, но в них содержатся также фосфотидилэтаноламин, фосфотидилинозит и др. Мембраны различных клеток, а также различных органоидов в пределах
1 Стехиометрическое взаимодействие означает такой процесс, при котором имеется вполне определенное количественное соотношение взаимодействующих частиц.
128
одной клетки могут обнаруживать значительное различие в составе липидов.
Раньше считали, что роль фосфолипидов сводятся к
приданию мембранам физической структуры и низкой
проницаемости для многих веществ. В настоящее время
установлено, что фосфолипиды играют более активную роль. В исследованиях Л. Хокина и М. Хокиной было показано, что если стимулировать прохождение веществ через клеточные оболочки, то этот процесс сопровождается химическими изменениями фосфолипидов — изменением соотношения различных фосфолипидов в мембранах. Обнаруженая метаболическая активность фосфолипидов представляет новое преспективное направлениеисследований.
В последнее время многими учеными развивается глобулярная теория строения мембраны. Во многих случаях на электронных микрофотографиях препаратов мембран, полученных после некоторых видов «нежесткой» фиксации и контрастирования, обнаруживаются глобулярные структуры. На этом основании Шестранд считает, что липидная фаза мембраны существует в виде глобулярных мицелл, представляющих комплекс липидных молекул, залитых в белковый матрикс. Другие ученые считают, что липидные глобулы не полностью окружены белками, а расположены между двумя слоями белка. Все же большинство исследователей (Шестранд Нильсон, Кавана и др.) склоняются к точке зрения, согласно которой субъединицы (блоки) биологических мембран образованы липидными глобулами, полностью окруженными белками и стабилизированным гидрофобным взаимодействием поверхностного слоя белковых молекул. Эти блоки имеют форму правильных шестигранных или пятигранных призм диаметром 8 — 14 нм. Блоки располагаются упорядоченно на расстоянии 8 — 10 нм от центра к центру, образуя в совокупности мембрану. В целом мембрана стабилизирована гидрофобными белок белковыми связями и белок-липидными взаимодействиями. При этом считают, что мембрана не имеет статической организации: форма глобулы в зависимости от функционального состояния мембраны может меняться и становиться или более вытянутой, или более уплощенной. В результате этого мембрана как бы «мерцает» или «пульсирует». В зависимости от той формы, которую принимают глобулы, между ними могут возни-
Медицинская биофизика
129
кать поры, размеры которых варьируют. Превращение глобул из одной формы в другую происходит за счет химической энергии АТФ, освобождаемой содержащейся в мембранах АТФ-азой. По данным Кавана, изменение размеров мембраны не связано с наличием специальных сократительных белков, а обусловлено изменением взаимодействия на границе липид — белок.
На основании вышеизложенного некоторые исследователи приходят к выводу, что мембраны могут иметь два типа организации — слоистую и глобулярную, которые, возможно, могут переходить друг в друга.
В последнее время в нашей стране и за рубежом появляются сообщения о том, что в состав биологических мембран входят рибонуклеиновые кислоты (РНК), В. С. Шапот с сотрудниками выдвинули гипотезу, согласно которой РНК в липопротеидных комплексах мембраны играет роль структурной основы, матрицы, на которой собираются в определенном порядке белки. Этот порядок детерминируется нуклеотидными последовательностями РНК, которые «узнают» тот или иной белок.
Хорошая проницаемость мембран большинства клеток для воды и многих водорастворимых веществ позволяет предположить существование в мембранах особых отверстий — пор. Диаметр пор определяется косвенным путем по размеру водорастворимых молекул, которые еще способны проникать через мембрану. С помощью этого и других методов было установлено, что у большинства клеток диаметр пор составляет 0,35 — 0,8 нм. Поры могут иметь структуру длинного извитого канальца. Количество пор в мембране невелико. В эритроцитах, например, вся площадь, приходящаяся на их долю, составляет примерно 0,06% от общей поверхности мембраны.
Поры изнутри выстланы слоем молекул белка (см. рис. 21). Полярные группы молекул белка направлены в сторону отверстия поры, а неполярные вступают во взаимодействие с молекулами липидов. Благодаря наличию полярных групп в порах они обычно обладают электрическим зарядом, что оказывает большое влияние на процесс проникновения растворенных частиц через поры.
Мембрана представляет собой элементарную структуру клеток. Мембраны образуют клеточные оболочки и оболочки органоидов клетки. Мембраны различных ор-
130
ганоидов отличаются химическим составом и толщиной. Например, оболочки митохондрий, состоящие из пяти слоев белков и липидов, представляют собой дубликатуру элементарной мембраны.
В некотором отношении очень интересны мембраны лизосом. Как известно, лизосомы содержат ферменты, разлагающие все наиболее важные вещества клетки. Эти ферменты не могут только разлагать и переваривать свою собственную мембрану. При разрушении мембраны лизосом ферменты выходят в цитоплазму и наблюдается явление аутолиза — самопереваривания клетки.
В клетках протекает сложнейшая сеть биохимических превращений, состоящая из тысяч отдельных реакций. Все эти реакции должны быть тем или иным способом отграничены друг от друга. Мембраны производят деление клетки на отдельные участки, фазы, где и протекают различные реакции. И в самом деле, мембрана, как правило, располагается на границе раздела двух фаз: наружная плазматическая мембрана отделяет внутреннюю среду клетки от наружной; мембраны митохондрий отделяют их матрикс от собственной цитоплазмы; мембраны ядра — кариоплазму от цитоплазмы; мембраны цитоплазматического ретикулума — содержимое цистерн от цитоплазмы и т. д. Все эти фазы отличаются друг от друга физико-химическими показателями: рН, концентрацией ионов, наличием ферментов, количеством воды, кислорода и т.д. Благодаря тому что мембраны создают границы раздела, возможно существование многих биохимических реакций.
Помимо того что мембраны создают границы раздела между различными фазами, они принимают непосредственное участие во всех процессах обмена веществ, которые обусловливают жизнедеятельность клеток. Различного рода мембранные структуры в организмах составляют колоссальную поверхность — десятки тысяч квадратных метров. Такая обширная структурная система указывает на ее важное функциональное значение. Во всех мембранных структурах имеются ферментные сиситемы. Во внутренней мембране митохондрий и эндоплазматического ретикулума сосредоточены такиеокистельные ферменты, как дегидрогеназы, флавины, цитохромы. В мембранных образованиях находятся также фосфотазы, ферменты активного переноса веществ (пермеазы), липолитические ферменты.
131
Приведенные данные убедительно свидетельствуют о том, что поверхность мембран представляет собой то место в клетке, где протекает большинство биохимических реакций. На это указывает и тот факт, что фермент АТФ-аза, играющий ключевую роль в обмене веществ, локализован в основном на мембранах (кроме актомиозина, находящегося в саркоплазме).
Наконец, функция мембран заключается еще и в том, что они координируют и регулируют биохимические и биофизические процессы в клетках. Сейчас становится все более очевидным, что мембраны являются своеобразным устройством, воспринимающим сигналы, поступающие извне, и преобразующим их в команды, регулирующие обмен веществ внутри клетки. В выполнении данной функции большое значение имеет такое свойство мембран, как проницаемость. В результате изменения проницаемости меняется скорость поступления и выведения веществ, изменяются стационарные концентрации реагирующих веществ в клетках и, следовательно, скорости биохимических и биофизических процессов. На важное значение проницаемости мембран в регуляции обмена веществ указывает тот факт, что многие гормоны (инсулин, адренокортикотропный гормон, минерало-кортикоиды, антидиуретический гормон) оказывают биологическое действие путем изменения проницаемости клеточных мембран. Некоторые функции мембран более подробно будут рассмотрены в последующих главах.
Нормальное состояние мембран клетки нарушается при многих заболеваниях, в особенности связанных с нарушениями гормонального и витаминного баланса организма. Обнаружены увеличение проницаемости мембран лизосом и выход в цитоплазму лизосомных ферментов при гипервитаминозе А, авитаминозе Е, при гипоксии, действии ионизирующих излучений, стрептолизина, эндотоксинов и т. п. Кортизон и гидрокортизон, напротив, способны стабилизировать мембраны лизосом, что, возможно, является одной из причин противовоспалительного действия этих соединений.
АДГЕЗИЯ КЛЕТОК
Клеточным мембранам принадлежит важная роль в обеспечении адгезии — сцепления клеток друг с другом, обусловливающего существование ткани. Соединение
132
клеток часто обеспечивается наличием на клеточных поверхностях специализированных структур, представленных выростами в стороны соседних клеток. В одних случаях эти структуры создают чисто механическое зацепление по типу: «гнездо — шип»; в других — между выростами, по-видимому, устанавливается химическая связь. Было обнаружено, что эмбриональные ткани, обработанные трипсином, распадаются на отдельные клетки. Так как трипсин действует на пептидные связи, то предположили, что последние могут играть роль связующего фактора. Наконец, предполагают, что межклеточная жидкость содержит склеивающее цементоподобное вещество. Основой механизма склеивания может быть органическая соль кальция, соединяющаяся с карбоксильными группами белков и фосфатными группами липидов. Это подтверждается тем, что с понижением концентрации кальция в межклеточной жидкости способность клеток к адгезии уменьшается.
Стабильность ткани зависит также от поверхностного заряда клеток. Наличие отрицательного заряда на поверхности клеток приводит к их взаимному отталкиванию, определяемому величиной электрокинетического потенциала (см. главу 8). Ткань является стабильной, если электрическое отталкивание клеток не превышает сил их сцепления.
Если действием трипсина вызвать полную дезагрегацию тканей куриного эмбриона, то через некоторое время наблюдается слипание однотипных клеток с образованием агрегатов из клеток соответствующей ткани (кости, почек, печени). Если смешать клетки зародышей разных видов, то последующая их адгезия обусловливается не видовой специфичностью, а тканевой принадлежностью. По-видимому, самоорганизация клеток по их специфичности обусловлена локализованным на клеточной поверхности специальным механизмом «узнавания себе подобных». Природа этого механизма еще не выяснена. Клетки различных тканей обладают не одинаковой способностью к адгезии. Способность к адгезии бывает ниже у малоспециализированных клеток. Клетки злокачественных опухолей не имеют специфичности и обладает более низкой способностью к адгезии, чем нормальные клетки. Пониженная способность к адгезии
133 |
может быть объяснена рядом причин. Поверхности опухолевых клеток обычно утрачивают
специализированные структуры, обеспечивающие механическую и химическую связь клеток. Содержание кальция в раковых опухолях снижено более чем в 2 раза по сравнению с нормальными тканями, что может быть причиной уменьшения сил межклеточного склеивания. Поверхностный заряд опухолевых клеток, определяемый по их электрофоретической подвижности, выше, чем у нормальных. Увеличение электрокинетического потенциала приводит, по-видимому, к тому, что возросшая сила электрического отталкивания опухолевых клеток перестает уравновешиваться силами взаимного сцепления, которые, напротив, у опухолевых клеток понижены. Поэтому опухолевые клетки по сравнению с нормальными обладают более высокой подвижностью, они легко отрываются от опухоли, уносятся стоками жидкости и образуют метастазы.
ИСКУССТВЕННЫЕ МЕМБРАНЫ
Свойства мембран часто исследуются на искусственных фосфолипидных мембранах, представляющих собой модели естественных мембран. Техника получения искусственных липидных мембран была разработана Лэнгмюром еще в 1917 г. Если на поверхность воды нанести каплю растворенных в каком-либо летучем растворителе фосфолипидов или жирных кислот, то после распределения их молекул по водной поверхности и испарения растворителя образуется мономолекулярная пленка. Как установил Лэнгмюр, при полном насыщении поверхностного слоя адсорбированные молекулы липидов располагаются перпендикулярно к поверхности воды таким образом, что в воду погружается гидрофильная полярная группа, а неполярная углеводородная цепь направлена вертикально вверх. Такой ориентированный слой молекул называют «частоколом Лэнгмюра».
Если стеклянную пластинку опустить в воду, на поверхности которой находится мономолекулярная пленка липидов, то эту пленку можно перенести на поверхность пластинки. При повторных погружениях на пластинке возникают бимолекулярные и даже полимолекулярные пленки, молекулы отдельных слоев которых соединяются друг с другом либо полярными, либо неполярными группами.
134
Рис. 23. Процесс образования искусственной мембраны при диффузиирастворителя в водную, фазу из капли раствора липидов, нанесенной на отверстие.
В 1962 г. Мюллер предложил более удобный способ для получения бимолекулярных пленок. Для этого берут тефлоновую пластинку с небольшим отверстием и на отверстие наносят каплю раствора липидов в смеси хлороформа с этанолом (рис. 23). Затем пластинку помещают в раствор хлорида калия. По мере диффузии растворителей из капли в водную фазу молекулы липидов по поверхностям сферы (на границах капли) приближаются друг к другу и в конце концов соединяются в довольно стабильный двойной слой, закрывающий отверстие. Такая мембрана может длительное время существовать в водных растворах солей, а также служить границей раздела солевых растворов различного состава.
После этого многие исследователи изучали электропроводность подобных мембран, транспорт через них ионов, их проницаемость для различных веществ, их гидратацию, а также их механические и оптические свойства. В результате этого выяснилось, что подобные бимолекулярные пленки являются хорошей моделью биологических мембран. Например, величины электрических емкостей и сопротивления таких мембран близки к величинам этих параметров клеточной мембраны. Если создавался концентрационный градиент через мембрану, то возникал потенциал покоя величиной порядка 150 мВ при 0,1 М растворах NаС1 и КСl на противоположных сторонах мембраны. В 1967 г. Мюллер и Рудин сообщил
что некоторые вещества (циклические антибиотики)
135
увеличивают электропроводность искусственных мембран приблизительно в 1000 раз. В дальнейшем выяснилось, что подобные вещества могут изменять проницаемость мембран для ионов, а также и для неионизированных частиц.
В 1968 г. Мюллеру и Рудину при добавлении в систему белков удалось получить мембраны, обладающие электрогенными свойствами. Они предположили, что один белок образует в мембране катионпроводящие поры, а второй добавленный белок — анионпроводящие поры. Эти мембраны при действии электрического тока обладали способностью генерировать импульсы, подобные потенциалам действия. Интересно, что ионы кальция блокировали ритмическое возбуждение мембран и повышали его порог, т. е. действовали так же, как и на клеточную мембрану. Возбуждение обратимо блокировалось также местными анестетиками группы кокаина в концентрации примерно 2%, что представляет особый интерес, поскольку это находится в области физиологических концентраций.
Таким образом, метод создания искусственных мембран позволяет изучать многие свойства клеточных мембран. Основная ценность этого метода заключается в том, что он позволяет более детально изучать сложные биофизические процессы в мембранах, поскольку исследования проводятся в сравнительно простых системах.
Ценность этого метода обусловлена также и тем, что на искусственных мембранах можно исследовать процессы самоорганизации биологических структур, которые пока еще очень слабо изучены и привлекают пристальное внимание ученых.