Активный транспорт веществ в клетках

Выше были рассмотрены основные виды пассивного транспорта веществ в клетках. Как указывалось, при массивном транспорте энергия метаболических процес-

157

сов не расходуется, а перенос веществ в клетках осуществляется по электрохимическому градиенту. Вследствие этого градиенты клетки имеют тенденцию к уменьшению — пассивный перенос всегда стремится выровнять неравномерность в распределении веществ между клеткой и средой. Но, как показывает опыт, клеточное со­держимое резко отличается по своему составу от окру­жающей клетку среды. В клетке содержатся в боль­ших количествах ионы калия, недиффундирующие ионы белков, фосфолипидов, анионы аминокислот и другие ионы органических веществ, содержание которых в жид­кости, окружающей клетку, незначительно. Другие веще­ства, напротив, в значительно более высоких концентра­циях содержатся в окружающей жидкости, чем в клетке, например ионы натрия. Такое неравномерное распреде­ление веществ между клеткой и средой не может быть полностью объяснено наличием только пассивного транс­порта веществ, который, как указывалось, всегда приво­дит к уменьшению электрохимических градиентов.

Вышеприведенные данные, а также ряд других, по­зволяют сделать заключение, что в клетках наряду с пассивным происходит и активный транспорт веществ. Перенос молекул и ионов против электрохимического градиента, осуществляемый клеткой за счет энтропии метаболических процессов, называется активным транспортом.

Осуществляя перенос веществ против градиента, клетка совершает определенную работу, которая назы­вается концентрационной или осмотической. Эта работа состоит, с одной стороны, в накоплении клеткой веществ,

присутствующих в окружающей среде в малых количествах, а с другой — в выведении в окружающую среду веществ, которые в самой этой среде присутствуют в высоких концентрациях.

Величина концентрационной работы при переносе незаряженных частиц только против сил диффузии (про­тив концентрационного градиента) может быть найдена из уравнения:                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                         (7)

где А — работа; т — количество молей вещества, перенесенного через мембрану из области с активной кон-

158

 

центацией вещества С ₂ в область с концентрацией С ₁ R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура. Если происходит перенос ионов через электрически поляризованную мембрану, то работа совершается не только против сил диффузии, но и против сил электри­ческого поля мембраны. В этом случае общая работа А может быть найдена из уравнения:

  (8)

где m— количество перенесенных грамм-ионов веще­ства; п — валентность ионов; F = 96 500 Кл — число Фарадея — заряд 1 г-экв ионов; Е ₁— Е ₂— разность потен­циалов между поверхностями мембраны; С ₁и С ₂ — ак­тивные концентрации ионов по одну и по другую сто­роны мембраны. Знаки плюс и минус в уравнении (8) показывают, что в зависимости от знака заряда ионов электрический градиент мембраны может иметь направление, либо совпадающее с направлением концентра­ционного градиента (плюс), либо противоположное ему (минус). Соответственно и работа по переносу ионов в электрохимическом градиенте равна либо сумме работ по переносу в концентрационном и электрическом гра­диентах, либо их разности.

Большинство гипотез механизма активного переноса базируется на предположении о существовании специальных переносчиков, захватывающих переносимое

сквозь мембрану вещество и доставляющих его на другую сторону клеточной мембраны. Возможно, что этот
переносчик пространственно ориентирован внутри мембраны в направлении, перпендикулярном ее поверхности, что дает ему возможность образовывать комплекс с пе­реносимой молекулой и в то же время ориентировать её проникновение в клетку.

Исходя из данных, имеющихся к настоящему време­ни, активный транспорт веществ разделяют на два вида: активный перенос ионов и активный перенос органиче­ских веществ, главным образом Сахаров и аминокислот. По-видимому, к активному транспорту следует отнести и такое явление, как пиноцитоз — «питье клеток», когда вещества поступают в клетку «упакованными» в клеточ­ную мембрану.

Явление активного переноса ионов к настоящему вре­мени обнаружено у большого количества клеток и тка-

159

ней. Интересный пример активного переноса представ­ляет кожа лягушки. Крогом было обнаружено, что эта ткань специализируется на переносе ионов натрия из ок­ружающей среды в интерстициальную жидкость, где их концентрация в 10 000 раз выше, чем в среде. Именно такой механизм лежит в основе снабжения тканей ля­гушки этими необходимыми для ее жизнедеятельности ионами. Впоследствии Уссингом с сотрудниками был разработан метод изучения активного транспорта натрия через кожу лягушки. Если разделить две камеры, содер­жащие нормальный раствор Рингера, свежеизолирован­ной кожей лягушки, то внутренняя поверхность кожи заряжается положительно по отношению к наружной. Разность потенциалов при этом достигает 100 мВ. Это так называемая «насосная» разность потенциалов, воз­никновение которой обусловлено активным переносом натрия. Подавая от внешнего источника ЭДС напряже­ние противоположного направления, можно скомпенси­ровать разность потенциалов через кожу. В этих усло­виях перенос ионов через кожу под влиянием электри­ческого поля невозможен, так же как и путем диффузии, так как растворы по обе стороны кожи идентичны. Однако продолжает иметь место перенос ионов натрия от наружной поверхности к внутренней, в чем можно убедиться, используя меченный натрий. О том, что имеет место однонаправленный перенос ионов натрия, можно судить и по наличию тока в компенсационной цепи. По­скольку разность потенциалов скомпенсирована, то ток в компенсационной цепи численно равен току, возни­кающему благодаря одностороннему переносу через кожу положительных зарядов, т. е. ионов натрия.

Перенос натрия через кожу лягушки непосредственно связан с обменом веществ. Многочисленные ингибиторы окислительных процессов приводят немедленно к сниже­нию или прекращению переноса ионов натрия и к ис­чезновению разности потенциалов через кожу. Анало­гичные явления наблюдались и в опытах с другими сложными мембранными системами.

Перенос ионов отчетливо выражен в различных се­креторных клетках — в слюнных и потовых железах и особенно в железах желудка, выделяющих большие ко­личества ионов водорода и хлора.

О высокой интенсивности процессов активного пере­носа ионов в клетках свидетельствуют данные термоди-

160

намических расчетов. Высчитано, что 10% энергии метаболизма мышцы лягушки в покое расходуется на пере­нос ионов натрия. Этот показатель возрастает до 50% в определенных условиях опыта, стимулирующих (перенос ионов.

Большое количество работ посвящено исследованию активного переноса ионов калия и натрия через клеточ­ные мембраны. Это объясняется их большой ролью в та­ких важных явлениях, как генерирование биоэлектриче­ских потенциалов и проведение возбуждения.

Как указывалось, ионы калия и натрия неравномер­но распределены между цитоплазмой клеток и межкле­точной жидкостью. В то же время данные, полученные с помощью изотопных методов, показали, что эти ионы могут диффундировать через мембраны. С помощью этих же методов было установлено, что при каждом акте возбуждения клетки приобретают определенное количе­ство ионов натрия и теряют эквивалентное количество ионов калия. В свете этих данных становится ясным, что поддержание электрохимических градиентов калия и натрия неизменными на протяжении всей жизни клеток возможно только в том случае, если эти ионы перено­сятся специальными механизмами против градиентов. Этот перенос будет компенсировать уменьшение гра­диентов, вызванное диффузией. И действительно, непо­средственные измерения с помощью радиоактивных ⁴²K и ²⁴Na показали, что большинство изученных клеток на­ходятся в стационарном состоянии. При этом скорость поступления данного иона внутрь клетки равна скорости потока ионов того же вида из клетки во внешнюю среду.

Кроме того, было установлено, что при выключении гликолиза и окислительного фосфорилирования ингиби­торами метаболических процессов (йод уксусная кислота, цианиды, динитрофенол и др.) неравномерность в рас­пределении ионов уменьшается вплоть до полного вы­равнивания их концентраций в клетке и во внешней сре­де. Если же путем микроинъекции в отравленное нерв­ное волокно кальмара ввести некоторое количество ЛТФ, то перенос ионов против градиентов возобнов­ляется. Неравномерность в распределении ионов умень­шается также при охлаждении клеток, приводящем к замедлению метаболических процессов. Так, при охлаж­дении эритроцитов человека до 2°С они начинают выделять ионы калия и поглощать ионы натрия до тех пор,

Медицинская биофизика

161

пока не установится ионное равновесие. Процесс пол­ностью обращается повышением температуры до 37 °С, На основе подобного рода опытов был сделан вывод, что перенос ионов калия и натрия против градиентов сле­дует рассматривать как активный процесс, поскольку он совершается за счет энергии клеточного метаболизма.

При более детальном изучении переноса калия и нат­рия было установлено, что выход ионов натрия из клеток зависит от концентрации ионов калия во внешней среде а перенос калия в свою очередь зависит от концентрации натрия в цитоплазме. Во-вторых, обнаружено, что те вещества, которые уменьшают выход ионов на­трия из клеток, оказывают такое же влияние и на по­глощение ионов калия. При этом уменьшение переноса калия не является простым электрическим следствием уменьшения переноса натрия, поскольку мембранный потенциал при этом не изменяется. Эти наблюдения на­ряду с другими позволили сформулировать гипотезу со­пряженного натрий-калиевого насоса, которой в настоя­щее время придерживаются большинство крупных уче­ных (Ходжкин, Катц, Шоу, Глинн, Кейнес и др.).

Предполагают, что перенос натрия и калия осущест­вляется специальным переносчиком белковой или белковолипидной природы. Переносчик на внутренней по­верхности мембраны захватывает из цитоплазмы ионы натрия и переносит их на другую поверхность. На на­ружной поверхности мембраны ионы натрия отщепля­ются, а к переносчику присоединяются ионы калия, с которыми он движется снова к внутренней поверхности мембраны.

Для описанного транспорта ионов против градиентов необходимо поступление энергии АТФ, реализация кото­рой происходит при действии фермента аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы). Из всех АТФ-аз, имеющихся в клет­ках, решающее значение для транспорта ионов натрия и калия имеет АТФ-аза, активируемая этими же ионами (Nа⁺ — К⁺ — АТФ-аза). Na⁺ — К⁺— АТФ-аза была открыта Скоу (1954) в мембранных фракциях нервных клеток. Впоследствии этот фермент был обнаружен во многих других клетках. Свое предположение об участии Na⁺— К⁺ — АТФ-азы в переносе ионов Скоу подтвердил тем, что обнаружил инактивацию этого фермента сердечны­ми гликозидами (оуабаином, строфантинами), которые тормозят перенос ионов.

162

В настоящее время факт локализации молекулярно­го механизма активного переноса ионов, а также Na⁺—К⁺—АТФ-азы в структуре самой мембраны не вы­зывает сомнения. Решающую роль в этом сыграли эксперименты с «тенями» эритроцитов и с заменой цито­плазмы клеток растворами различных электролитов. Так, из аксона кальмара (диаметром 0,5 мм) можно удалить всю аксоплазму и заполнить его вновь раство­ром электролитов с добавкой АТФ. На таком препарате, в котором сохранена лишь мембрана и отсутствует эк­топлазма, удается наблюдать перенос ионов против гра­диентов концентрации и регистрировать потенциалы покоя и распространяющиеся потенциалы действия (см. также с. 189).

В нервной и почечной тканях, как установлено экспе­риментально, весь процесс переноса ионов протекает в три стадии: киназную, ионообменную и фосфатазную.

Первая стадия активируется ионами натрия. В этой стадии происходит фосфорилирование белка-переносчи­ка и присоединение к нему ионов натрия:

АТФ + белок + Na⁺ <===>   Na⁺ — белок ~ Ф + АДФ.

Возможно, что белок-переносчик и Nа⁺ — К⁺ — АТФ-аза — одно и то же вещество, подобно тому как актомиозин является и сократительным комплексом мышц и АТФ-азой одновременно. Эта стадия заканчивается переносом ионов натрия на внешнюю поверхность мембраны. Ка­ков молекулярный механизм этого переноса, пока не ясно. По предположению Опита и Чарнока, он заклю­чается в конформационных изменениях белковых моле­кул при фосфорилировании и присоединении ионов, в результате чего центры связывания ионов оказываются локализованными то с внешней, то с внутренней сторо­ны мембраны. Как уже упоминалось в главе 5, подоб­ный же механизм, по мнению Кеннеди, лежит в основе активного транспорта аминокислот и Сахаров. Эти пред­положения можно считать вероятными в связи с тем, что по данным ряда авторов (Василец, Нейфах и др.), из клеточных мембран удалось выделить сократитель­ные белки, близкие к актомиозину мышц. Эти белки обладали Nа⁺ — К⁺ — АТФ-азными свойствами и чувстви­тельностью к сердечным гликозидам.

Вторая стадия, протекающая на внешней поверхно­сти мембраны и активируемая ионами калия, заклю-

II*

163

чается в обмене ионов натрия на ионы калия:

и в переносе последних через мембрану.

Цикл заканчивается на внутренней поверхности мем­браны дефосфорилированием переносчика и освобож­дением ионов калия:

До настоящего времени не удалось выяснить один из важных вопросов при работе натрий-калиевого насо­са: чем объясняется, что на внутренней поверхности мембраны переносчик обладает сродством к натрию, а на внешней — к калию.

Исследуя энергетику описанного процесса, Ходжкин показал, что энергия гидролиза одной молекулы АТФ может обеспечить перенос одного иона против разности электрохимического градиента приблизительно в 400 мВ. Такой перенос был бы экономичен три транспорте во­дородных ионов через мембраны клеток желудка, имею­щих примерно соответствующую величину разности электрохимических потенциалов. Но в нервных клетках, имеющих разность электрохимических потенциалов всего 120 мВ, такой перенос был бы неэкономичен. Поэтому Ходжкин предположил, что при распаде одной молеку­лы АТФ должно переноситься 2 — 3 иона натрия. Впо­следствии этот расчет был подтвержден многими иссле­дователями для ряда тканей; было показано, что при гидролизе одного моля АТФ переносится 2 — 3 г-экв натрия.

Существуют данные, что натрий-калевый насос мо­жет работать в нескольких режимах. Он может перено­сить ионы калия и натрия в соотношениях 1:1, 1:2, 1: 3. Наконец, может наблюдаться перенос одних ионов натрия без переноса ионов калия. Было показано, что выход ионов натрия из клетки продолжается, хотя и с меньшей скоростью, после удаления из наружной среды ионов калия. Глинном и Постом была установлена точ­ная стехиометрия ионного обмена в эритроцитах чело­века. Оказалось, что в этих клетках на каждые 2 по­глощаемых иона калия выделяется 3 иона натрия.

До настоящего времени не было обнаружено явлений активного переноса анионов, в связи с чем считают, что

164

их распределение между клеткой и средой происходит пассивно¹.

Кроме активного переноса минеральных ионов, су­ществует активный перенос органических веществ, в частности Сахаров, аминокислот, нуклеотидов. Механиз­мы активного переноса органических веществ в настоя­щее время исследованы недостаточно.

Как и при активном транспорте ионов, при активном транспорте органических веществ перенос осуществля­ется против градиентов концентрации и требует затраты химической энергии клеток. В результате активного транспорта органических веществ наблюдается их не­равномерное распределение между цитоплазмой и внеш­ней средой. При ингибировании обменных процессов клетки неравномерность в распределении органических веществ уменьшается.

Имеются данные, что транспорт органических ве­ществ также связан с Nа⁺—К⁺ — АТФ-азой. Было уста­новлено, что транспорт органических веществ зависит от концентрации ионов натрия внутри клеток и угнетается строфантином, который, как указывалось, является инги­битором Na⁺ — К⁺ — АТФ-азы. Следовательно, транспорт органических веществ непосредственно сопряжен с транспортом ионов.

Все виды активного переноса веществ являются в то

же время и избирательным переносом, так как клетка

поглощает этим путем из окружающей среды только те

вещества, которые необходимы для ее жизнедеятель-

ности.

Как предполагает ряд исследователей (Рубинштейн, Драбкин, Уссинг, Пасынский), активный перенос необя­зательно предполагает участие активного переносчика типа белковых молекул, меняющих свою конформацию. Частично эти представления были рассмотрены выше при изложении сущности теории мембранных градиен­тов Д. Л. Рубинштейна.

Локализация некоторых ферментов в мембране позво­ляет несколько по другому объяснить активный перенос. Вещество А из внешней среды может на поверхности мембраны перейти в результате ферментативной реак­ции в какой-либо производное X (например, глюкоза в

¹ Исключением из этого правила является, возможно, транспорт попав йода в клетках щитовидной железы.

165

Рис. 27. Модель активного переноса вещества.

A — исходное вещество; X — производное вещество; пунктирные стрелки диффузия; сплошные стрелки — ферментативное превращение вещества.

глюкозофосфат при участии АТФ и фермента гексокиназы). В результате этого концентрация вещества X около мембраны возрастает, а концентрация исходного веще­ства А уменьшается. Это приводит к тому, что произ­водное вещество X начинает поступать по градиенту концентрации через мембрану в глубь клетки (рис. 27). С другой стороны, исходное вещество А также по гра­диенту концентрации движется из внешней среды к поверхности клетки. Внутри клетки производное X вновь превращается в исходное вещество А (например, глюкозофосфат в глюкозу под действием фермента фосфатазы), которое может накапливаться в клетке в сколь угодно больших количествах, поскольку (перенос осуще­ствляется не по градиенту этого вещества, а по градиен­ту вещества X. Таким же образом вещество А может проникнуть через следующую мембрану и т.д. Если мембрана проницаема для вещества А, то оно будет диффундировать из клетки в среду, когда его концент­рация в клетке превысит концентрацию в среде, т. е.. будет наблюдаться утечка вещества А из клетки.

Таким образом, активный перенос не означает, что вещество А в неизменном виде переносится против гра­диента его концентрации. Возможно, это энергия метабо­лических процессов как раз затрачивается на такие мо­лекулярные превращения Л, при которых на каждом этапе переноса движение происходит по градиенту кон­центрации производных данного вещества, но суммар­ный баланс процесса переноса А (сахаров, аминокислот

166

и др.) соответствует передвижению против градиента концентрации.

Таким образом, между пассивным и активным транс­портом веществ нет непереходимой грани. С одной сто­роны, пассивный транспорт происходит по градиентам, которые возникают в результате активного транспорта; с другой стороны, сам активный транспорт — противоградиентный процесс — сопряжен с градиентным про­цессом более высокого порядка — гидролизом АТФ. Здесь понятие «градиентный процесс» применяется в широком смысле и обозначен процесс, протекающий с уменьше­нием свободной энергии. Как уже указывалось в главе 2, противоградиентные процессы всегда имеют местный характер, поскольку они всегда сопряжены с другими — градиентными процессами. В конечном счете суммарный процесс в любой системе является градиентным и при­водит к уменьшению свободной энергии системы и воз­растанию энтропии. Убыль свободной энергии открытой системы компенсируется ее новым поступлением из ок­ружающей среды; а в изолированной системе устанав­ливается термодинамическое равновесие. Окисление про­дуктов питания, а затем гидролиз АТФ с освобожде­нием свободной энергии и являются теми градиентными процессами, которые обусловливают противоградиентиые (процессы в клетках, одним из которых является активный транспорт веществ.

Глава 7 БИОЭЛЕКТРИЧЕСКИЕ ПОТЕНЦИАЛЫ

Все процессы жизнедеятельности организмов сопро­вождаются появлением в клетках и тканях электродви­жущих сил. Электрические явления играют большую роль в важнейших физиологических процессах: возбуждении клеток и проведении возбуждения по клеткам. Благодаря непосредственной связи биопотенциалов с метаболическими процессами и физологическим состоя­нием клеток они являются чувствительным и точно из­меримым показателем различных изменений в клетках и норме и при патологии. Для более эффективного и

167

плодотворного использования электрофизиологических методов в медицине необходимо выяснение механизмов возникновения биоэлектрических потенциалов.