Хемилюминесценция и ее диагностическое

ЗНАЧЕНИЕ

Молекулы могут переходить в возбужденное состоя­ние не только при поглощении квантов света, но и за счет химического взаимодействия с другими молекула-

84

 

ми. В последующем при переходе молекул в основное состояние может возникнуть свечение, называемое хемилюминесценцией. Спонтанная хемилюминесценция де­лится на три основных вида: митогенетическое излучение, биолюминесценция, или экзотическая люминесцен­ция, и сверхслабое свечение. Необходимым условием всех видов хемилюминесценции является химическая реакция окисления.

Митогенетическое излучение — это ультрафиолето­вое излучение (190—320 нм), субстратом которого слу­жат белки и углеводы. По мнению А. Г. Гурвича (1923), это излучение стимулирует клеточное деление.

Биолюминесценция — воспринимаемое глазом свече­ние (420—710 нм), присущее многим организмам (бак­териям, светлячкам, некоторым рыбам, грибам и про­стейшим). Во всех случаях биолюминесценция являет­ся результатом ферментативного окисления особых ве­ществ— люциферинов, молекулы которых при окисле­нии способны переходить в возбужденное состояние. Фермент, катализирующий окисление люциферинов, по­лучил название люциферазы. Природа люциферина в различных видах организмов может быть различной. Люциферин светлячков по своей природе близок к ри­бофлавину, а люциферин бактерий — к флавинмононуклеотиду.

В настоящее время люциферин и люцифераза выделены в чистом виде и свечение воспроизведено в раст­воре. Анализ кинетики реакции показал, что вначале образуется фермент-субстратный комплекс, после чего происходит окисление люциферина молекулярным кислородом. При окислении комплекс переходит в возбужденное состояние и способен испускать квант света.

Сверхслабое свечение, обнаруженное Б. Н. Тарусовым, А. И. Поливодой, А. И. Журавлевым в 1961 г.,— это излучение живых организмов, тканей, клеток, их гомогенатов и некоторых биосубстратов в видимой и инфракрасной области спектра (360—800 нм). Его мож­но зарегистрировать при помощи специального прием­ника излучения — фотоэлектронного умножителя с фотометрической установкой, работающей в режиме счетчика фотонов.

Введение объективного метода регистрации позво­лило установить, что сверхслабое свечение присуще многим реакциям в биологических объектах. Было вы-

85

 

 

яснено, что свечение сопровождает окислительные ре­акции экзотермического характера — в основном реак­ции цепного типа, развивающиеся по радикальному ме­ханизму (см. главу 4). Показано, что интенсивность свечения пропорциональна скорости рекомбинации сво­бодных радикалов. При взаимодействии двух радикалов их неспаренные электроны образуют пару или хими­ческую связь. В процессе образования этой связи, иду­щей через промежуточное возбужденное состояние, избыток электронной энергии высвечивается в (виде кван­та. Эти данные позволили применить метод регистра­ции свечения для исследования роли возбужденных со­стояний молекул в различных процессах и для анализа свободнорадикальных реакций. Б. Н. Тарусов и А. И. Журавлев показали, что свечение тканей связа­но с неферментативным окислением липидов, которое непрерывно протекает в норме во всех тканях и явля­ется одним из показателей гомеостаза. Свободнорадикальное окисление оказывает катаболическое действие на организм. Оно определяется, во-первых, конкурен­цией свободнорадикального окисления с ферментатив­ным окислением — дыханием, во-вторых, цитотоксическим действием. Продукты свободнорадикального окис­ления — альдегиды, кетоны, перекиси, радикалы — мо­гут оказывать деструктивное влияние на все системы и структуры клетки.

В организме свободнорадикальное окисление тор­мозится системой тканевых антиокислителей, в которую входят аскорбиновая кислота, адреналин, сульфгидрильные соединения, каротиноиды, токоферолы и фосфолипиды. Развитие цепного и свободнорадикального окисления в тканях может быть патогенетической ос­новой некоторых заболеваний. При этом сверхслабое свечение тканей может служить диагностическим те­стом (А. И. Журавлев, А. И. Журавлева, 1975). Наря­ду с этим при других заболеваниях изменения интен­сивности свечения могут дать дополнительную инфор­мацию о нарушении первичных физико-химических про­цессов в организме.

В последнее время были проведены исследования свечения плазмы и сыворотки крови в условиях стресса и при различных заболеваниях. При стрессе интенсив­ность свечения плазмы крови увеличивается, что указы­вает на усиление в крови активности свободнорадикаль-

86

 

ного окисления. При этом, по мнению А. И. Журавле­ва, продукты окисления усиливают деструктивные процессы в клетках. За повышенную энергетическую го­товность организм расплачивается временным усилением деструктивных процессов.

И. М. Бондарев с соавт. (1972) показали, что воспалительный процесс в легких сопровождается активиза­цией свободнорадикального окисления и соответствую­щим повышением уровня свечения сыворотки крови. При этом интенсивность свечения зависит от степени выраженности воспалительного процесса.

Изучение сверхслабого свечения сыворотки крови животных при злокачественных новообразованиях выявило фазные изменения уровня свечения. Сразу после перевивки опухоли и в течение нескольких суток люминесценция заметно усилена. Фаза развития опухоли ха­рактеризуется пониженной интенсивностью свечения крови. Исследования на больных людях выявили аналогичную закономерность: уровень свечения сыворотки крови больных злокачественными болезнями оказался пониженным по сравнению со свечением сыворотки крови здоровых людей. В период роста опухоли в ней происходит накопление антиокислителей, транспортируемых кровью из других органов. Повышенное содержа­ние антиокислителей в крови может быть одной из причин снижения интенсивности свечения сыворотки крови. Подавление свободнорадикального окисления в опухоли исключает возможность токсического действия продуктов окисления и тем самым способствует более быстрому росту опухоли. В фазе распада опухоли со­держание антиокислителей в сыворотке крови становится ниже, чем в норме. Свечение сыворотки также усиливается по сравнению с нормой.

Таким образом, интенсивность свечения сыворотки крови дает возможность диагностировать три основные фазы развития опухоли как фазы, по-разному влияю­щие на интенсивность радикального окисления.

Измерение интенсивности хемилюминесценции мож­но использовать для дифференциальной диагностики заболеваний легких. Изменение интенсивности свечения сыворотки крови туберкулезных и опухолевых живот­ных было противоположно направленным: повышенным у животных с туберкулезом легких и пониженным у животных с перевиваемой опухолью. Аналогичные ре-

87

 

 

зультаты были получены при исследовании больных людей. У больных туберкулезом легких независимо от его формы свечение сыворотки крови повышено по сравнению с нормой. У больных раком легкого свечение сыворотки крови оказалось ниже, чем у здоровых лиц.

МИГРАЦИЯ ЭНЕРГИИ

Энергия излучения, поглощенная одной молекулой, может быть передана другой, близко расположенной молекуле. Обычный путь переноса энергии в биологических системах — это диффузия богатых энергией фос­форных соединений, которая осуществляется в раство­рах. Однако существуют и другие пути переноса энер­гии. Эти пути — так называемая миграция энергии — имеют особенно важное значение в фотобиологических, радиобиологических и, возможно, в некоторых биохимических процессах. Миграция энергии — это безызлучательная передача энергии от молекулы к молекуле на расстояния, значительно превышающие межатомные, происходящая без растраты в тепло и без кинетических соударений донора и акцептора энергии.

Когда молекула поглощает энергию, то электрон с основного энергетического уровня переходит на более высокий, возбужденный уровень. При движении этих электронов по орбитам в молекуле создается перемен­ное электромагнитное поле. Частота колебаний этого поля определяется энергетическим уровнем возбужден­ного электрона. Если рядом с возбужденной молекулой находится невозбужденная молекула, которая имеет энергетический уровень, совпадающий или несколько меньший уровня возбужденной молекулы, то возникает явление резонанса. При этом невозбужденная молеку­ла возбуждается, а возбужденная — переходит в невозбужденное состояние, т. е. энергия возбужденной моле­кулы почти целиком передается невозбужденной моле­куле. Это бывает тогда, когда частота испускаемых электромагнитных колебаний донора энергии совпадает с частотой колебаний акцептора энергии. Схематически описанные процессы можно изобразить так:

 

 

Для возникновения миграции необходимы следующие условия:

88

 

1. Донор энергии должен обладать способностью к созданию распространяющегося электромагнитного по­ля, т. е. способностью к люминесценции.

2. Частота колебаний электромагнитного поля доно­ра должна совпадать с частотой колебаний акцептора. Для этого необходимо, чтобы спектр люминесценции донора перекрывался со спектром поглощения акцеп­тора.

3. Необходимо, чтобы донор и акцептор были сближены на достаточное расстояние. Вероятность миграции резко уменьшается при увеличении расстояния между молекулами (вероятность миграции обратно пропорци­ональна расстоянию между молекулами в шестой сте­пени). Поэтому эффективная миграция происходит, если донор и акцептор достаточно сближены (1—10 нм).

Миграция энергии возбуждения может наблюдаться как по синглетным, так и по триплетным уровням. Направление миграции обусловлено вторым законом термодинамики и всегда соответствует переходу электронов с более высокого уровня в доноре на более низкий в акцепторе.

Наличие миграции определяют с помощью спектральных методов. Если обнаруживается, что вещество, непосредственно не участвующее в фотохимической ре­акции, начинает люминесцировать (сенсибилизирован­ная люминесценция), то это говорит о наличии мигра­ции энергии, т. е. о том, что молекулы этого вещества получили энергию от других молекул, непосредственно участвующих в поглощении света.

Рассмотренный тип миграции энергии называется резонансным, поскольку он осуществляется в результа­те резонанса донора и акцептора энергии. Эффектив­ность (вероятность) миграции энергии резонансным способом у белков составляет всего несколько процен­тов, поэтому данный вид переноса энергии для них су­щественного значения не имеет. Эффективность резо­нансной миграции энергии для нуклеиновых кислот до­стигает 30%. Резонансная миграция энергии может достигать 100% в системах с высокой концентрацией хромофоров —соединений, содержащих систему сопря­женных кратных связей.

В некоторых случаях возбужденный электрон может перемещаться от одной молекулы к другой вдоль возбужденного уровня. «Дырка», возникающая после ухо-

89

 

да электрона, может перемещаться вслед за ним по этому уровню. Такая перемещающаяся пара электрон— «дырка» называется экситоном, а миграция энергии, осуществляющаяся с помощью экситона, называется экситонной миграцией. В отличие от резонансной экситонная миграция энергии может осуществляться на сравнительно большие расстояния.

Экситонная теория была применена при рассмотрении переноса энергии всистемах, содержащих биоло­гические пигменты: родопсин, хлорофилл и др. Предпо­лагают, что в процессе фотосинтеза хлоропласты могут функционировать как своеобразные полупроводниковые образования. Поглощение света может приводить к об­разованию в молекуле хлорофилла свободных электро­нов и положительных «дырок». Электроны и «дырки» движутся и обусловливают окислительно-восстанови­тельные процессы. Электрон может осуществлять восста­новление какого-либо акцептора, так как восстановле­ние — это присоединение молекулой электронов. «Дыр­ка» может осуществлять окисление молекул, так как присоединение «дырки» означает отдачу электрона, т. е. окисление.