Холинопозитивные вещества
М-холиномиметики. М-холиномиметическим действием могут обладать вещества типа ацетилхолина, антихолинэстеразные препараты и вещества, избирательно реагирующие с М-холинореактивными системами (типа пилокарпина). Наблюдения на интактных мышах и изолированных органах позволяют провести первичный отбор соединений с биологической активностью этого типа (см. табл. 4), исследуемых затем с помощью описываемых ниже методик.
Изолированный глаз. Отбирают мышей, крыс или морских свинок с пигментированной радужкой. Животное забивают, глаз энуклеируют и удаляют роговицу. Глаза кратковременно отмывают в растворе Кребса и затем помещают в полусферическое углубление черной ванночки. Последнюю заполняют 20 мл бикарбонатного буферного раствора Кребса – Рингера и помещают на платформу микроскопа. Через раствор непрерывно пропускают карбоген. Температуру раствора поддерживают на уровне 37±0,5° с помощью 75-ваттной тепловой лампы, контактного ртутного термометра и электронного реле. Диаметр зрачка измеряют с помощью микрометрической шкалы окуляра микроскопа при увеличении в 30 раз. Глаза помещают в камеру и затем через 30 минут адаптации измеряют диаметр зрачка. После этого меняют раствор на свежий раствор Кребса, содержащий определенную концентрацию исследуемого вещества. Экспозиция действия составляет обычно 30 мин. Реакция выражается отношением диаметра зрачка после воздействия исследуемого вещества к контрольному (Beaver, Riker, 1962). Ориентировочные эксперименты могут быть также поставлены на энуклеированном глазе лягушки. Глаз помещают на предметное стекло с углублением (для работы с висячей каплей), погружаемое в ванночку с 5 мл раствора Рингера. Измеряют величину зрачка через 15 мин, после энуклеации и через 5, 10 и 15 мин после воздействия исследуемого вещества.
Изолированная трахея крысы (Jamieson, 19.62). Трахею свежезабитых крыс помещают в раствор Кребса-Генселейта. Один конец ее соединяют с U-образной трубкой, другой — с капиллярной трубкой диаметром 1 мм. Трахею затем переносят в ванночку для изолированных органов, содержащую 10 мл раствора Кребса-Генселейта, насыщаемого карбогеном при температуре 37°. Капиллярная трубка высотой 200 мм располагается вертикально над трахеей и прикрепляется к миллиметровой шкале. Жидкость в капилляре устанавливается на 70-100 мм выше уровня ванночки, затем U-образная трубка отключается и все последующие изменения высоты жидкости в капилляре зависят лишь от изменения объема трахеи. Через 10 мин уровень жидкости в капилляре стабилизируется. Обозначим диаметр трахеи в состоянии расслабления — D, С — диаметр в сокращенном состоянии, V — объем трахеи, L — ее длина, h — высота жидкости в капилляре диаметром 1 мм. Если условно допустить, что величина D постоянна, тогда при
сокращении трахеи 
Таким образом, значение С (диаметр трахеи в сокращённом состоянии) пропорционально квадратному корню изменений высоты жидкости в капилляре.
При экспозиции 1 
– 3 мин действующую дозу исследуют каждые 5-8 мин. Между исследованиями ванночку промывают по крайней мере дважды. Результаты экспериментов, полученные с помощью этой методики, сходны с данными опытов на изолированных кольцах трахеи (Castillo, de Beer, 1947).
Антихолинэстеразные вещества. Стимуляция лакримации является одним из наиболее простых методов индикации, антихолинэстеразных веществ (Burgen, 1949). Суть его заключается в определении пороговой дозы ацетилхолина, вызывающей слезотечение, на фоне действия исследуемого вещества. Наиболее удобным объектом являются крысы, дающие довольно выраженную и постоянную реакцию на ацетилхолин. Используют крыс-самцов весом 100-200 г с отклонением веса в группе не более±15 г. Готовят 0,1% раствор ацетилхолина на 0,1% растворе однозамещенного калия фосфата (стабилизатор) в изотоническом растворе натрия хлорида. Этот раствор ацетилхолина может храниться в холодильнике до 15 дней (рН 4,2-4,3), Определяют пороговую дозу ацетилхолина для каждого животного. Раствор ацетилхолина вводят подкожно. При позитивной реакции на фильтровальной бумаге, помещенной в конъюнктивальный мешок, появляется красно-коричневое пятно (хромодакриорея). Дозу ацетилхолина варьируют с интервалом в 40 мкг, начальная доза составляет 140 мкг. Эффект наблюдается через 3-5 мин. Пороговая доза колеблется в пределах 80-250 мкг. Для группы из 6 крыс пороговой считается доза, вызывающая реакцию у половины животных. Внутри группы пороговая доза ацетилхолина не должна отклоняться от средней более чем на ± 30 мкг. Тесты с ацетилхолином можно проводить каждые полчаса. После определения пороговой дозы для всей группы животных крысы остаются в клетке в течение 30 мин. Затем внутрибрюшинно им вводят исследуемое вещество. Во время максимальной активности действия вещества ацетилхолиновый тест повторяют. Перед опытом каждой крысе вводят физостигмин в дозе 0,25 мкг. При этом пороговая доза ацетилхолина снижается с 200 до 20 мкг. Активность вещества оценивается по соотношению
Стандартное отклонение от средней при определения активности физостигмина обычно составляет 3% (Burgen, 1949). Исследуемые вещества обычно сравнивают на уровне десятикратного усиления активности ацетилхолина при логарифме отношения, равном 1. Кратковременно действующие вещества могут быть исследованы на одной и той же группе животных повторно в течение 1-го дня. Отрицательные логарифмы доз веществ в молях на 1 кг веса, вызывающих десятикратное усиление действия ацетилхолина для физостигмина сульфата и прозерина, равны соответственно 6,11 и 7,05. Представляет также интерес методика определения активности М-холинолитических препаратов (см. следующий раздел), основанная на предупреждении слезотечения, вызываемого ацетилхолином у кошек (Winbury е. а., 1949).
Холинонегативные средства
М-холинолитики. Активность М-холинолитиков может быть выявлена в связи с обнаруживаемой уже в наблюдениях на мышах симптоматикой выключения парасимпатического отдела вегетативной нервной системы (см. табл. 4). Для подтверждения наличия специфического М-холинолитического действия позднее может быть использован ряд простых и достаточно адекватных методик.
Мидриаз. Для изучения мидриатической активности наиболее часто используют мышей и кроликов (De Jongh e. a., 1955). В опытах на мышах измеряют диаметр зрачка в исходном состоянии и после введения исследуемого вещества каждые 10 мин в течение 1-го ч и затем на 90-й и 120-й мин.
Величина зрачка выражается в единицах измерения, равных 0,04 мм; учет ее проводят с помощью микрометрического, окуляра микроскопа. Качественно мидриатический эффект считается положительным, если диаметр зрачка достигает 1,2-1 мм. Для количественного анализа исследуют как минимум 4 дозы на 60 мышах. Вещества, активность которых установлена этим тестом, могут быть затем исследованы на препарате верхнего шейного ганглия кошки для дифференциации М-холинолитического и ганглиоблокирующего эффектов.
Наблюдения на глазе кролика. В левый глаз кролика (3 кролика в группе) закапывают по 2 капли 0,1% раствора атропина, в левый глаз трех других кроликов вводят исследуемое вещество (по 2 капли). Правый глаз подопытных кроликов является контролем. Диаметр зрачка в обоих глазах измеряют в определенные промежутки времени, средний эффект выражается в процентах величины зрачка по отношению к контролю. В качестве препарата-эталона обычно используют атропин, вызывающий увеличение зрачка в среднем на 42% в течение 50 ч. Этот тест может быть одновременно использован и для исследования местнораздражающего действия препаратов. Для этого специально отмечают степень гиперемии, отечность и другие симптомы раздражения конъюнктивы.
Торможение саливации. Учет снижения саливации может быть проведен в опытах на кроликах и крысах. В качестве стимулятора саливации используют пилокарпин, исследуемые вещества назначают за 30-60 мин до его введения. Предварительно отбирают животных, дающих саливацию при введении пилокарпина в дозе 5 мг/кг. В качестве препарата-эталона используют атропин в дозе 20-50 мкг/кг. Интенсивность действия исследуемых веществ следует сравнивать с атропином по данным экспериментов на одних и тех же животных, так как индивидуальная чувствительность животных выражена весьма резко.
Торможение спастических сокращений кишечника. Исследуемые вещества вводят мышам линии Swiss-Webster, через желудочный зонд в виде водных растворов или комплексов со слизями. Объем раствора не должен превышать 5.0 мл/кг веса тела. Через. 30 мин после введения растворимых солей или 2 ч спустя после введения взвеси в слизях животных анестезируют пентобарбиталом (2 мг в 0,2 мл воды внутрибрюшинно). Затем обнажают кишечник и наносят, локально метахолин (0,25 мкг в 0,2 мл). Если метахолиновый спазм полностью предупреждается, эффект оценивается двумя единицами; если спазм уменьшается по своей интенсивности или развивается на ограниченном участке, эффект оценивается единицей. Вместо метахолина может быть использован карбохолин. Интенсивность эффекта выражается в процентах максимальной активности и подсчитывается средняя доза, предупреждающая спазм, по методу Литчфильда и Уилкоксона.
Длительность эффекта определяют путем испытания каждой дозы на 20 мышах в различные интервалы после введения вещества, ED50 атропина сульфата, скополамина гидробромида, метилатропина и метилскополамина равны соответственно 42, 34, 6, 2 и 9 мг/кг (Berker, McCarthy, 1960).
Лакримация. Тест проводят на крысах весом 150-225 г. В течение 10 мин до начала опыта животные находятся при температуре 36°. Исследуемые вещества вводят в вену хвоста в растворах из расчета 1 мл/кг в течение 20 с. Карбохолин в дозе 0,5 мг/кг вводят внутрибрюшинно через 15, 45, 75 и 105 мин до получения позитивной реакции. Появление окрашенного.пятна на ватном тампоне, прижатом к глазу, в течение 3 мин после инъекции карбохолина свидетельствует о положительной реакции. Отсутствие цветного пятна в указанный промежуток времени расценивается как следствие М-холинолитического эффекта. ED50 по этому тесту для атропина равна 13,8 мкм/кг (De Jongh e. a., 1955).
Тесты на изолированных органах. Изолированную прямую мышцу живота лягушки подвешивают в ванночке, содержащей 7 мл раствора Рин-
Рис.9. Схема аппарата для работы на изолированных органах:
С — ванночка с питательной жидкостью; Ci — резервуар с водой; Р — отрезок кишки; В — трубка для подачи кислорода; Н и О — трубки для заполнения и выливания жидкости; Тр — терморегулятор; П — фиксирующая пластина.
гера (De Elio, 1948). Жидкость заменяют каждые 5 мин раствором Рингера, содержащим ацетилхолин (10-7). Стимулирующий эффект записывается в течение 90 с на ленте кимографа. После отмывания раствором Рингера мышца возвращается к исходному состоянию. Эта реакция на ацетилхолин довольно постоянна и регистрируется трижды в начале каждого эксперимента. Затем за 90 с до воздействия ацетилхолина жидкость меняют на раствор исследуемого вещества. Отмечается изменение эффекта на последующее воздействие ацетилхолина. Регистрируют концентрацию вещества, тормозящую полностью эффект ацетилхолина, или концентрацию, уменьшающую его действие на 50%.
Изолированный кишечник кролика. Два сегмента кишки кролика подвешивают в ванночке ёмкостью 70 мл (рис. 9), содержащей 0,07 мг ацетилхолина в 0,7 мл воды (De Jongh e. a., 1955). Через минуту исследуемую дозу М-холинолитика растворяют в 0,5 мл воды и добавляют в ванночку на 2 мин. Затем ванночку промывают 5 раз физиологическим раствором и процедуру повторяют. Атропин используют как стандарт для сравнения активности исследуемых веществ. Для ускорения получения результатов может быть использован четырехкамерный бокс, в который добавляют три концентрации исследуемого вещества, четвертая служит стандартом. Заключение базируется по крайней мере на 64 альтернативных ответах, полученных на 8 полосках кишечника. Для установления соотношений между активностью исследуемого вещества и атропина данные обрабатывают по методу Литчфильда и Уилкоксона. Так, в частности, если активность атропина принять за 100, активность скополамина равна 160. С соблюдением описанных приемов исследования опыты могут быть также поставлены на кишечнике мышей.
Ганглиоблокаторы. Некоторые общие симптомы интоксикации ганглиоблокаторами могут проявляться в экспериментах на интактных мышах (см. табл. 4). В частности, обнаруживаемый в этих наблюдениях мидриаз может быть отнесен за счет возможного действия ганглиоблокаторов в случаях отсутствия симптоматики симпато-миметического и атропиноподобного действия. Для более определенного решения этого вопроса необходимо использование одного или нескольких методов индикации ганглиоблокирующего действия, описываемых ниже.
Антагонизм к никотину. Мышам-самкам (в каждой группе по 10 животных) вводят внутрибрюшинно исследуемое вещество и через 30 и 90 мин в течение 1-2 с внутривенно — никотин в дозе 840 мкг/кг в растворе из расчета 0,005 мл/г (Stone е. а., 1958).
Эта доза никотина вызывает у 100% мышей клонические судороги с резким повышением двигательной активности, в 92% — тонические судороги и в 87% — смерть.
Немедленно после введения никотина мышей помещают на приподнятую деревянную прямоугольную платформу (21×28 см2), имеющую бортик высотой 1,2-1,8 см. После введения никотина мыши обычно находятся на платформе приблизительно 5 с. Исследуемые вещества могут удлинить время пребывания на платформе. При выключении клонической фазы судорог мыши остаются на платформе в течение 15 с. Если не развиваются тонические судороги и смерть, дозу вещества расценивают как профилактическую. ED50 (предупреждающая появление клонических судорог) для мекамиламина, пентолиния и бензогексония равны соответственно 0,92, 4,70 и 22 мг/кг. С помощью описанной методики было установлено, что между величинами ED50 ганглиоблокаторов и их мидриатическим эффектом прямой зависимости нет (Tripod, 1949).
Тестирование на нижнем веке крысы. Белых крыс весом 200 г наркотизируют внутриперитонеальным введением 60 мг/кг пентобарбитала-натрия. Голову крысы фиксируют зажимом при положении животных на столике-термостате на спине. Для облегчения дыхания в трахею вводят канюлю. Шейный симпатический нерв отпрепаровывают, после перевязки рассекают и погружают в парафин. Стимуляция осуществляется через серебряные электроды. Используют прямоугольные, импульсы продолжительностью 250 мкс. Тонкую шелковую нить проводят через нижнее веко и фиксируют пластилином к зеркалу, подвешенному на гибкой проволоке. Если веко сокращается, луч отраженного света скользит по поверхности фотоэлемента, выход которого подается на регистрирующий аппарат. Сокращения можно регистрировать также с помощью механотрона. Шейный симпатический ствол стимулируют импульсами супрамаксимального, вольтажа в течение 5 с. Исследуемые вещества вводят внутривенно. Степень сокращения нижнего века зависит от частоты стимуляции. Около 25 циклов в минуту обычно достаточно для получения максимального сокращения.
Пороговые дозы некоторых веществ, вызывающие сокращение века: адреналин — 0,5 мкг/кг, норадреналин 1,25 мкг/кг, фентоламин — 5 мг/кг (блокада), ТЭА 25 мк/кг (блокада), ацетилхолин — 50 мкг/кг (Gertner, 1956).
Результаты опытов показывают, что гладкие мышцы нижнего века крысы иннервируются только адренергическими нервными волокнами.
Влияние на кровяное давление при ортостатической нагрузке. Фиксация кроликов в вертикальном положении (рис. 10) повышает чувствительность животных к вазодилататорам и ганглиоблокаторам. Это обстоятельство используется при скриннинге ганглиоблокаторов. Кроликов весом
Рис. 10. Схема станка для сообщения кроликам ортостатической нагрузки (М. Л. Рылова, 1962):
1 — опорная доска; 2 — металлическая стойка; 3 — отверстие для фиксации поворотной доски в горизонтальном положении; 4 — ось вращения; 5 — опора для задних лап кролика; 6 — отверстия для крепления задних лап кролика; 7 — отверстие для фиксации доски в вертикальном положении; 8 — вращающаяся доска; 9 — стержень для крепления головодержателя; 10 — зажим для крепления завязок; 11 — опорная стойка; 12 — штифт; 13 — металлическая муфта с отверстием для фиксации.
1,5-2 кг помещают в бокс с температурой воздуха, равной температуре тела. С помощью капсулы, предложенной Гранта (1934), регистрируют давление, необходимое для закрытия центральной артерии уха, до введения вещества и в различное время его действия. Для измерения кровяного давления могут быть также использованы кролики с выведенной в кожную муфту общей сонной артерией. Исследуемые соединения вводят в 0,3 мл солевого раствора в краевую вену левого уха. Испытания сильнодействующих и кумулирующих веществ проводят каждые 3-5 дней. Кроме сдвигов кровяного давления, у животных может наблюдаться мидриаз, саливация, дефекация и полиурия.
Миорелаксанты. Исследование острой токсичности на мышах позволяет выявить ряд эффектов, характерных для действия миорелаксантов, таких, как нарушения мышечного тонуса, координации движений и т. д. (см. табл. 4).
Для дальнейшего отбора миорелаксантов широко практикуются испытания на интактных кроликах с использованием теста склонения головы. Кролики (по 5-10 в группе) получают постепенно возрастающие дозы исследуемого вещества внутривенно в течение 5 с в объеме 1 мл раствора на 1 кг. Реакцию рассматривают как позитивную, когда кролик склоняет голову к полу и не может поднять ее, несмотря на легкий удар по носу. Определяются ED50 и сопоставляются с аналогичной дозой для Д-тубокурарина или другого известного препарата этого типа.
Френико-диафрагмальный препарат. Крупных крыс забивают обескровливанием. После удаления кожи над грудной клеткой последнюю вскрывают справа от грудины и затем производят разрез проксимальнее места прикрепления диафрагмы. Передняя часть
Рис 11. Схемы экспериментальных установок для работы с френико-диафрагмальным препаратом.
А. Перфузируемый диафрагмальный препарат крысы (Gilberd, 1966):
1 – сегмент диафрагмы, 2 – канюля, введенная в нижнюю полую вену (последняя перевязывается ниже уровня диафрагмы); 3 – электроды для раздражения диафрагмы; 4 – перфузат, 5 – термостат.
Рис. 11. Схемы экспериментальных установок для работы с френикодиафрагмальным препаратом.
Б. Френико-диафрагмальный препарат (Lewis, 1964): 1 — питательная жидкость; 2 — мягкий парафин; 3 — нерв; 4 — сегмент диафрагмы; 5 — диафрагмальный нерв; 6 — электроды для раздражения диафрагмального нерва; 7— раствор Тироде с двойным количеством глюкозы; 8 — терморегулятор.
левой грудной стенки удаляется и осторожно выделяется диафрагмальный нерв. Обе доли левого легкого удаляют. Из диафрагмы вырезают веерообразную полоску. Разрезы производят параллельно мышечным волокнам диафрагмы в 3 мм слева и справа от места вхождения диафрагмального нерва. Полоску выделяют с диафрагмальным нервом длиной около 2,5 см. Препарат фиксируют в ванночке для изолированных органов. Сухожильный конец диафрагмы соединяют нитью с регистрирующим рычагом. Нерв стимулируют электрическим током с частотой не более 12 импульсов в минуту. Ванночку заполняют раствором Тироде (100 мл) с двойным количеством глюкозы, через который пропускается карбоген (рис. 11). В другой модификации (Chou, 1947) диафрагма может стимулироваться непрерывно до появления максимальных сокращений. Экспозиция действия исследуемого вещества составляет 3 мин. Затем препарат отмывают непосредственно после окончания воздействия вещества и через 2,4 и 6 мин повторно. Следующую индикацию проводят через 5 мин после заключительного отмывания. Такой порядок опыта дает удовлетворительное восстановление мышечных сокращений. Важно, чтобы доза препарата не вызывала торможения сокращений более чем на 50%. Процент торможения устанавливают после измерения исходной амплитуды сокращений и ее изменений на 3-й мин действия вещества. d-Тубокурарин в дозах 1, 1,4, 1,8 и 2 мкг/мл вызывает уменьшение амплитуды соответственно на 13, 30, 49 и 65% Частота стимуляции не должна превышать 20 имп/мин, в противном случае мышца быстро утомляется. Для скриннинга курареподобных веществ можно использовать икроножную мышцу лягушки, однако более удобна портняжная мышца, сокращения которой восстанавливаются полнее после действия миорелаксантов. Заслуживает внимания методика регистрации сокращений диафрагмы в экспериментах на целом животном (Г. А. Патрушев, Н. Ф. Сопиков, 1965), однако необходимость использования крупных животных (собаки, кошки, кролики) ограничивает ее применение в начальной стадии скриннинга. Следует, однако, заметить, что в последнее время описана методика регистрации диафрагмального дыхания в опытах на крысах (С. Г, Бачев, 1971), что открывает широкие возможности использования этого теста при отборе миорелаксантов.
Тест со стрихнином. Определенный интерес для экспресс-скриннинга миорелаксантов может представлять выявление их антагонистического влияния на летальный эффект стрихнина. Исследуемые вещества вводят внутрибрюшинно группам мышей (по 5 животных в группе), затем в период максимума эффекта мышам внутривенно вводят стрихнин в дозе 0,75 мг/кг в 0,01% растворе со скоростью 0,02 мл/с (LD98). Дозу исследуемого вещества, предупреждающую смертельный исход в 50% случаев, определяют по методу Миллера и Тэйнтера (1944).
Описан также ряд методик изучения продолжительности (Л. А. Кравчук, 1966) и количественной оценки интенсивности действия миорелаксантов (А. И. Терехина,1966).
Для суждения о механизме действия миорелаксантов могут быть поставлены эксперименты с исследованием влияния ингибиторов холинэстеразы на их курареподобный эффект. Ингибиторы холинэстеразы потенцируют действие деполяризирующих миорелаксантов (типа сукцинилхолина) и тормозят эффект препаратов антидеполяризирующего действия (типа d-тубокурарина). Эти дополнительные исследования могут быть проведены с использованием любой из представленных выше методик исследования миорелаксантов.
Адренопозитивные вещества
Во время изучения острой токсичности на интактных мышах могут проявляться такие симпатомиметические эффекты, как мидриаз, повышение глубины и частоты дыхания, повышение двигательной активности и ряд других симптомов (см. табл. 4). Описываемые ниже методы служат для уточнения специфичности действия исследуемых веществ на адренорецепторы.
Мидриаз. Особенность действия симпатомиметиков заключается в том, что они вызывают увеличение диаметра зрачка без существенного влияния на аккомодацию глаза или рефлексы на свет. При определении симпатомиметической активности на мышах величина зрачка может быть измерена по методике, используемой для оценки действия М-холинолитиков (см. стр. 56). Однако представляется желательной более точная оценка мидриаза в опытах на крысах. После внутривенной инъекции 0,04 мг/кг адреналина у крыс через 30 с наблюдается максимум увеличения зрачка (на 2 мм). Реакция сохраняется на протяжении 8 мин.
Матка и нисходящая толстая кишка крыс. Для уменьшения спонтанной активности матки используют (в качестве питательной жидкости) рингеровский раствор с пониженным содержанием кальция (до 0,06 г на 1 л) или снижение температуры раствора до 29-30°. Объем раствора в ванночке составляет 2 мл. Матку животных после недавней беременности не используют ввиду ее высокой спонтанной активности. Сокращения матки регистрируют механографически или с помощью трансдюсера — механотрона. Ацетилхолин (0,5 и 1 мкг) прибавляют в ванночку каждые 2 мин и затем после развития максимального эффекта (через 30-40 секунд) препарат отмывают. Адреналин в объеме не свыше 0,21 мл прибавляют в ванночку за 1 мин до ацетилхолина. Если эффект ацетилхолина не изменяется, то дозу адреналина или исследуемого вещества увеличивают. Изменения реакции на ацетилхолин являются показателем активности симпатомиметиков.
Аналогична техника использования начальной части восходящей прямой кишки крысы. В этом случае температура раствора в ванночке поддерживается на уровне 25±2°. Рингеровский раствор используют без изменений или модифицируют следующим образом: натрия хлорида 9 г, калия хлорида 0,4 г, кальция хлорида 0,03 г, натрия бикарбоната 0,15 г, глюкозы 1 г.
Ацетилхолин применяется в дозах от 0,001 до 0,01 мкг. Таким же образом при скриннинге определяют дозы исследуемого вещества, вызывающие снижение реакции на ацетилхолин на 50% (Turner, 1965).
Прямая кишка курицы. Используют часть слепой кишки курицы или петуха 14-20-недельного возраста, выдержанной в модифицированном растворе Тироде в течение 2-40 ч при температуре 4° (Cleugh е. а., 1961). Оптимальное время предварительной экспозиции составляет 18 ч. Отрезок кишки длиной 3-5 см подвешивают в ванночке с раствором в объеме 3-5 мл. Движения продольной мышцы регистрируют при усилении амплитуды в 15 раз и статической нагрузке 1-5 г. Температура жидкости в ванночке 34-35°. Питательный раствор идентичен жидкости Тироде за исключением уменьшенного в 10 раз содержания магния хлорида; через раствор постоянно пропускают карбоген. Цикл тестирования, продолжается 4 мин. Вещество исследуют в течение 30 с перед промыванием. Эфедрин в разведении 5×10-6 расслабляет мышцу и тормозит спонтанные сокращения. Препарат более чем в 40 раз чувствительнее к адреналину, чем к норадреналину. Удобен для оценки активности субстанции Р. Реакцию препарата на исследуемые вещества сравнивают, с активностью адреналина.
Рис. 12. Препарат изолированной селезенки собаки (Leaders е. а., 1965): 1— регистрирующее устройство; 2 — перфузат, поступающий в артерию; 3— электроды для стимуляции нерва селезенки; 4 — оттекающий перфузат; 5 — селезенка.
Изолированная селезенка кошки. Под нембуталовым наркозом у кота производят экстирпацию селезенки (De Gues e. a., 1956). Через день хранения в рефрижераторе при 40 селезенку рассекают так, чтобы получить полоски ткани длиной 4 см и шириной 0,5 см. Затем эти отрезки фиксируют в стеклянной тканевой ванночке. Сокращения полоски записывают на кимографе с увеличением амплитуды в 20 раз при статической нагрузке на рычаг, составляющей 2 г. Ванночку заполняют раствором Тироде в объеме 50 мл, который постепенно подогревают до 37,5°. Раствор насыщают смесью кислорода с тремя процентами углекислого газа. После периода расслабления (2 ч) в ванночку прибавляют исследуемые вещества. Повышение тонуса полоски наблюдают при воздействии адреналина в разведении 10-7, норадреналина 10-7, мезатона 10-7. Указанные препараты могут быть использованы как эталоны для сравнения активности испытуемых веществ.
Весьма перспективной представляется также методика с использованием перфузируемой под постоянным давлением селезенки собаки (рис. 12), позволяющая одновременно регистрировать влияние исследуемых веществ на тонус сосудов селезенки и ее контрактильные свойства (Leaders е. а., 1965).
В заключение следует отметить, что физиологическая активность симпатомиметических веществ чрезвычайно разнообразна и может быть оценена с помощью ряда дополнительных методов фармакологического исследования.
Адренонегативные вещества
Изыскание средств, тормозящих эффекты симпатической иннервации, является одной из наиболее интенсивно и успешно разрабатываемых областей современной фармакологии. В настоящее время к адренонегативным веществам относится ряд групп препаратов с различным механизмом действия: а) ингибиторы образования катехоламинов (метилДОФА и др.); б) пресинаптические симпатолитики (гуанетидин, резерпин, орнид и др.); в) блокаторы альфа- и бета-адренореактивных систем.
Некоторые черты классического адренонегативного действия выявляются уже в процессе начального скриннинга на мышах (см. табл. 4). Ниже представлены тесты на адренонегативную активность.
Антагонизм с адреналином. Этот метод основан на определении дозы исследуемого вещества, снижающей LD67 адреналина до LD34. Используют мышей обоего пола весом 19-21 г. Препараты в растворе объёмом 0,1 мл вводят мышам (по 20 животных в группе) per os. Два часа спустя каждой мыши внутрибрюшинно вводят 14,4 мг/кг адреналина гидрохлорида, который обычно вызывает гибель 67,0±1,5% контрольных мышей (при необходимости дозу адреналина увеличивают до получения этого эффекта). Адренонегативный эффект оценивают по снижению летальности мышей до 34%. Варьируя дозы в логарифмической шкале, можно построит ED50, т. е. дозу, уменьшающую смертность мышей вдвое. Смертность определяют через час после инъекции адреналина. Согласно этой методике, ED50 йохимбина гидрохлорида равна 23 мг/кг, дибенамина — 48 мг/кг и прискола 7,4 мг/кг (Loew, Micetich, 1948).
В другом варианте используют крыс самцов (весом 80-120 г), которые из всех лабораторных животных являются наиболее чувствительными к адреналину. Исследуемое вещество вводят в объеме 0,2 мл раствора на 100 г веса тела внутривенно в течение 2-3 с. Стандартный раствор адреналина (0,02%) готовят на 0,01% растворе аскорбиновой кислоты в дистиллированной воде. К 0,1 мл такого раствора прибавляют 0,1 мл раствора исследуемого вещества. Доза адреналина 200 мкг/кг в 2,7 раза более его LD50 при внутривенном введении. Контрольные животные при введении этой дозы погибают от отека легких в течение нескольких минут. Для количественной оценки эффекта используют 5 доз вещества с интервалом логарифма дозы 0,3. Каждую дозу исследуют на 10 или более крысах. Процент смертности крыс через 24 ч переводится в пробиты и наносится против логарифма дозы. ED50 определяют из графика, стандартную ошибку высчитывают по методу Миллера и Тэйнтера (1944). ED50 и стандартная ошибка для аминазина равны 21,5 ± 4,6 мкг/кг, фентоламина —15,0 ± 2,9, феноксибензамина — 32,5 ±8,5 и эргометрина — 86,7 ± 16,3 мкг/кг.
Расслабление мигательной перепонки. Учитывают степень и продолжительность расслабления мигательной перепонки у интактных кошек. Наличие нормальной реакции зрачков на свет используют как показатель отсутствия М-холинолитического эффекта. Препарат назначают в дозах до 3 мг/кг. При отсутствии расслабления мигательной перепонки вещество расценивают как неактивное. Относительная активность исследуемых веществ выражается путем деления средней продолжительности расслабления (в часах) на дозу (в мг/кг). В качестве препарата-эталона используют гуанетйдин (Short е. а., 1963).
Кровяное давление у крыс. Крыс весом 200-250 г наркотизируют уретаном (Linder е. а., 1963). Кровяное давление в сонной артерии измеряют ртутным манометром.
Для некоторых веществ может быть вычислен коэффициент активности, представляющий частное от деления суммы максимального гипотензивного эффекта (в мм рт. ст.) и длительности действия (в минутах) на двойную дозу вещества (в мг/кг). Более удобным объектом для сравнения активности веществ с помощью этого коэффициента являются кошки. Многие резерпиноподобные вещества имеют коэффициент выше 150 (150-1283) и составляют группу веществ, наиболее активных по этому тесту.
Полоска селезенки кошки. Изучение механизма действия исследуемых веществ производят обычно после первичной фармакологической оценки, когда становится ясной фармакологическая активность.
Используют кошек обоего пола, наркотизируемых внутривенным введением 45 мг/кг этаминала-натрия (Innes, 1962). Готовят отрезок селезенки 25-30 мм длиной и 2-3 мм шириной. Каждая полоска должна включать часть капсулы, так как в противном случае препарат получается очень хрупкий. Затем полоски закрепляют в ванночках, содержащих 10 мл раствора Кребса-Генселейта при температуре 38°. Раствор насыщается карбогеном. На кимографе регистрируются изотонические сокращения при усилении амплитуды в 5 
раз и статической нагрузке 0,5 г.
Исследование проводят по следующей схеме: действие исследуемого вещества (5 мин), адреналин (5 мин), отмывание (2 мин), затем феноксибензамин (5 мин), адреналин (5 мин) и после этого цикл можно повторить. Раствор альфа-адренолитика феноксибензамина в подкисленном пропиленгликоле (2,5%) хранят как маточный и разводят в день использования 0,9% раствором натрия хлорида. При воздействии феноксибензамина сокращения полоски составляют 0-4% исходной амплитуды. Действие исследуемого вещества сопоставляют с действием феноксибензамина. В качестве индикатора степени адренонегативного действия используют адреналин.
Предполагается, что в селезенке кошки имеются три вида эфферентных систем, реагирующих соответственно с ацетилхолином, гистамином, адреналином и серотонином. Общность эфферентных систем в некоторых органах для адреналина и серотонина доказана в результате ряда специальных экспериментов (И. В. Комиссаров, 1969).
Препарат селезенки открывает широкие возможности для исследования точек приложения действия, исследуемых веществ. Используя этот метод, можно обнаружить симпатолитические средства, антисеротониновые препараты, антигистаминные и М-холинолитические вещества.
Более удобной представляется методика скриннинга, предложенная Linder с соавторами (1963), при которой используют полоски селезенки в оксигенированном растворе Рингера, содержащем тартрат адреналина (2,5 мкг/мг). Исследуемые вещества оставляют в контакте с тканью селезенки в течение 20 мин. Определяют относительную активность исследуемых веществ (по интенсивности расслабления полоски селезенки) в сравнении со стандартом дигидроэрготоксина тартратом.
Сосуды уха кролика с сохраненной иннервацией (М. П. Николаев, 1941). Кролика, фиксированного спиной вверх, наркотизируют внутривенным введением уретана (1,5-2 г/кг). Ухо его закрепляют на стеклянной пластинке, фиксированной в штативе под углом в 45° (рис. 13). Под отпрепарованные большой аурикулярный и малый затылочный нервы (последний располагается по переднему краю уха) подводят лигатуры. В большую артерию уха вставляют канюлю. Ухо отсекают; связь его с организмом осуществляется через интактные нервы. Производят тщательный гемостаз в зоне культи уха. Перфузию производят оксигенированным раствором Рингера-Локка под давлением 55-70 см вод. ст. Жидкость, оттекающую из вен уха, регистрируют при помощи гуттометра.
Исследуемые вещества вводят внутривенно для изучения центрального действия или в перфузируемый раствор для определения периферического эффекта. В последнем случае влияние исследуемых веществ можно оценивать по изучению реакции сосудов уха на центральную стимуляцию тонуса симпатической нервной системы.
Альфа- и бета-блокирующие эффекты. При скриннинге адренонегативных веществ специфика их действия дает основание для суждения о преимущественном их действии на альфа- или бета-адреноререцепторы.
Общие реакции, связанные с возбуждением альфа-адренорецепторов, следующие: 1) сокращение, гладких мышц сосудов (этот эффект наиболее выражен в сосудах кожи и почек); 2) расширение зрачка, сокращение мигательной перепонки, сокращение радиальных мышц радужки (экзофтальм); 3) сокращение гладких мышц селезенки; 4) сокращения матки (этот эффект наблюдается у всех видов животных, но наиболее резко выражен у кроликов, собак и беременных кошек); 5) сокращение ретрактора полового члена и семенных пузырьков; 6) сокращение пиломоторов.
Бета-адренорецепторы более чувствительны к адреналину, блокируются дихлоризопротеренолом, анаприлином и не чувствительны к альфа-адреноблокирующим веществам.
С возбуждением бета-адренорецепторов связаны следующие эффекты: 1) расслабление гладких мышц сосудов; 2) дилятация мышц бронхов; 3) расслабление матки (эффект наиболее выражен на крысах и небеременных кошках); 4) расслабление гладких мышц кишечника; 5) позитивный инотропный эффект на сердце (повышение метаболизма в миокарде).
Влияние на гликогенолиз в печени и другие метаболические эффекты катехоламинов реализуются через бета-адренорецепторы.
Для обнаружения бета-адреноблокирующей активности, как правило, используют объекты с высоким уровнем физиологической активности бета-адренорецепторов. Весьма интересным представляется применение в качестве индикатора изопротеренола (изадрина) — вещества, обладающего избирательным возбуждающим действием на бета-адренореактивные системы. Эффект исследуемых веществ целесообразно сопоставлять с действием наиболее известных бета-адреноблокаторов, например анаприлина.
Серотониночувствительные рецепторы делятся на М- и Д-рецепторы, блокируемые соответственно морфином и дибензилином. Блокада эффекта морфином показывает, что исследуемое вещество действует через М-рецепторы. С аналогичной целью используют и дибензилин. При воздействии дибензилина на кишечник морской свинки в течение 30 минут наблюдают необратимую блокаду Д-рецепторов (Gaddum, Picarelli, 1957). Для определения степени торможения активности серотониночувствительных рецепторов применяют пробу с серотонином. Кроме морфина, М-рецепторы блокируются атропином, кокаином, фенадоном. Д-рецепторы, помимо дибензилина, выключаются диэтиламидом лизергиновой кислоты, дигидроэрготамином и некоторыми другими препаратами. Наиболее удобными объектами для тестирования серотониноактивных веществ являются изолированный отрезок тонкого кишечника морской свинки, матки крысы и изолированное ухо кролика.
Довольно простая методика выявления периферических М- и Д-антагонистов серотонина в опытах на мышах предложена Л. С. Роговой (1972), где в качестве теста использовано торможение экзофтальма и диареи, вызываемых внутривенным введением серотонина (10 мг/кг).
В результате ряда исследований показано наличие третьего вида серотониночувствительных рецепторов, ответственных за развитие триады Бецольда-Яриша и коронарные хеморефлексы, однако выявление этого рода активности серотониноподобных веществ довольно сложно технически и выходит за пределы возможностей первичного скриннинга.
