Исследование общего действия веществ на интактных лабораторных животных

Реферат

 

Изучение биологической активности природных соединений и новых продуктов синтеза является одним из важнейших направлений изыскания эффективных лекарственных средств.

Настоящая работа посвящена изложению основных методических приемов первичного фармакологического исследования, используемых в экс­периментальной практике для обнаружения возможных лечебных свойств новых соединений.

В книге приведено более 130 методик первичного фармакологического исследования и ряд справочных материалов, полезных при проведении этого этапа работы.

Пособие предназначено для начинающих исследователей – фармакологов, токсикологов, гигиенистов, химиков и фармацевтов, работающих в области изучения физиологической активности новых природных и синтетических соединений.

 

Введение

Исследование биологической активности новых продуктов синтеза и природных соединений представляет интерес с двух точек зрения: с одной стороны, это необходимый этап изыскания новых лекарственных средств, с другой — подобные исследования важны для токсикологической характеристики новых соединений. Трудно переоценить значение данных первичного фармакологического анализа для оценки возможного токсического действия синтезируемых химической промышленностью веществ, все более широко применяемых в различных областях народного хозяйства.

Система методик первичного фармакологического исследования в настоящее время привлекает пристальное внимание не только в связи с их применением для выявления и изучения основных свойств лекарственных ве­ществ в экспериментальной фармакологии, но и весьма важна для обеспечения методической вооруженности исследователя широкого профиля, работающего в области изыскания новых лекарственных веществ и токсикологии.

Отсутствие пособий по методическим приемам, используемым на начальном этапе фармакологического исследования, и явилось причиной попытки обобщения и систематизации современных методик обнаружения и экспериментального анализа основных форм физиологической активности исследуемых соединений.

В настоящей работе мы не считали необходимым подробно останавливаться на методиках, хорошо известных из курса фармакологии. Относительно менее употребительных приемов исследования, оригинальных методик и модификаций, достаточно известных, можно сказать, что они описаны довольно детально. Методы начального этапа фармакологического исследования новых соединений систематизированы по основным разделам частной фармакологии. При их отборе учитывались два основных требования, предъявляемых к первичному фармакологическому исследованию лекарственных веществ: быстрота получения результатов и их достоверность и минимум ма­териальных затрат.

При необходимости объем первичного изучения лекарственных веществ может быть расширен за счет использования дополнительных методик, указанных в соответствующих разделах при рассмотрении основных приемов начального этапа фармакологического анализа биологически активных веществ.

В приложении представлен ряд справочных материалов, которые могут быть полезны для начинающего исследователя при проведении первичного фармакологического исследования и оценке его результатов.

 

 

Общие принципы первичного фармакологического

Исследования веществ

Начальный этап фармакологического исследования новых природных и синтетических соединений подчинен задачам возможно быстрого выяснения общих черт биологической активности изучаемого вещества при минимуме затрат и риска негативной оценки веществ, имеющих ценные фармакологические свойства. Оптимальное разрешение этих вопросов представляет проблему весьма сложную и не всегда выполнимую на начальном этапе первичного фармакологического исследования. Опасность пропуска ценных фармакологических веществ при ограниченном количестве применяемых методов исследования и биологических объектов остается весьма существенной. Без расширения объема тестов, выявляющих биологическую активность исследуемых веществ, вероятность ошибок может быть снижена лишь за счет высокой квалификации исследователя, проводящего и оценивающего ре­зультаты экспериментов.

Практика исследований физиологической активности новых соединений указывает на необходимость проведения следующих основных этапов работы: 1) изучения общего действия исследуемых веществ на интактных лабо­раторных животных; 2) исследования токсического действия веществ и характера изменений, приводящих к гибели животных; 3) избирательного исследования фармакологической активности, базирующегося на данных, полученных в ходе изучения общего действия и токсичности новых соединений; 4) проведения специальных тестов для выявления активности, не обнаруживаемой при изучении острой токсичности и общем скриннинге (веще­ства типа инсулина, антипиретики и др.).

Эти этапы первичного фармакологического исследования составляют начальную стадию изыскания и изучения новых лекарственных веществ (рис. 1).

Отбор животных для эксперимента. При первичном фармакологическом исследовании веществ желательно использовать определенные виды животных и их линий, наиболее чувствительных к данному классу соединений. Однако не следует забывать и о том, что эксперименты на беспородных мышах позволяют обнаружить более широкий диапазон активности соединения. Важное значение для выявления эффекта и его стабильности имеют такие факторы, как возраст животных (аминазин, например, вызывает гипертермию у мышей в возрасте до 10 – 38 дней – Bliss, Catteli, 1943), их реактивность, а также постоянство внешних условий среды при проведении эксперимента. При предварительном отборе необходимо учитывать функциональные показатели животных. Это обеспечивает получение более стабильных, достоверных и сравнимых результатов. Ниже при описании некоторых методик первичного фармакологического исследования будут рассмотрены приемы отбора животных по функциональным показателям.

 

 

Рис. 1. Схема исследования новых лекарственных веществ.

 

Исследование общего действия веществ на интактных лабораторных животных

 

В настоящее время детально разработана оценка общего действия веществ по данным поведенческих реакций, нервно-мышечной возбудимости и некоторым вегетативным эффектам. Ниже приведена схема многотестового наблюдения на мышах (табл. 1), наиболее подробно описанная Irwin (1958). Оценка действия веществ, вызывающих функциональные сдвиги, в общих чертах может быть произведена по пятибалльной системе (табл. 2).

Используемая рядом исследователей шкала от 0 до 8 (Irwin, 1964; Turner, 1964), где цифрой 4 обозначалось отсутствие эффекта, представляется менее удобной для сравнения получаемых данных с параметрами, характе­ризующими исходное состояние подопытных животных. Стабильность оценки сдвигов функциональных показателей по предлагаемой шкале определяется квалификацией наблюдателя. На первом этапе работы и позднее для контроля объективности оценок наблюдателя целесообразно практиковать включение серий интактных мышей (по методу двойного контрольного исследования).

Поведенческие реакции. Возбудимость мышей оценивается по общему уровню двигательной активности, степени их агрессивности и может указывать на стимуляцию центральной нервной системы и резкие функциональные сдвиги в сфере вегетативной иннервации. Повышение возбудимости нередко характерно для состояния, предшествующего развитию судорог. Реактивность мышей рассматривается в связи с характером реакции животных на изменение окружающей обстановки (перемещение на открытый стол, площадку с перегородкой и отверстиями в ней и т. д.). Настороженность оп­ределяется ориентировочными рефлексами, обонятельной реакцией. При этом можно использовать стандартный звуковой раздражитель. Специально отмечается агрессивность мышей. Пугливость животных оценивается при проведении осторожных стандартных манипуляций с мышами, например при прикосновении корнцангом. Писк мышей может указывать на резкое повышение чувствительности и токсическое действие препарата, определяющиеся с помощью актографа или субъективно в процессе наблюдения.

 

 

 

Условные обозначения: 3 – Op. p., Об. р. – соответственно ориентировочная и обонятельная реакции; 11—Ш., С – соответственно шатающаяся и скованная походка;.15 – П., С – соответственно прострация и скованность; 16—Ф., Э. – соответственно сгибание и разгибание конечностей.

 

 

Нервно-мышечная возбудимость. Тремор, судороги и рефлексы положения расцениваются согласно принятой шкале при визуальном наблюдении (рис. 2). Нарушение походки может указывать на изменение тонуса скелетных мышц и развитие атаксии центрального генеза. Положение хвоста мышей и степень его подъема (тест Штрауба) характеризуют степень возбуждения спинальных мотонейронов, ответственных за регуляцию тонуса мышц хвоста. Регистрируется также реакция на прикосновение к коже шеи, живота и болевая реакция при наложении зажима на основание хвоста. Отмечаются изменения положения тела (прострация, скованность) у мышей, находящихся в обычной позе и после придания им необычной позы. Эти изменения могут

 

Таблица 2

ШКАЛА ОЦЕНКИ ЭФФЕКТА ВЕЩЕСТВ ПРИ НАБЛЮДЕНИИ НА МЫШАХ

 

 

быть обусловлены депрессией и связанными с ней нарушением про-приоцепции, миорелаксацией или развивающимся параличом. Положение конечностей (сгибания, разгибания) оценивают по сравнению с таковым у контрольных мышей. Общий тонус скелетных мышц может быть оценен по отдергиванию передней лапки при захватывании ее, а также по состоянию тонуса брюшных мышц.

Рис. 2. Степень угнетения рефлексов положения (Irwin, 1964): 1 – нормальное положение тела мыши: 2 – 5 – последовательно возрастающее угнетение рефлексов положения.

Рефлексы. Оценивается интенсивность реакции отдергивания головы при раздражении роговицы (роговичный рефлекс) и слухового прохода и сдвиги во времени ипселатерального сгибательного рефлекса, возникающего при сдавливании лапы зажимом с постоянным уровнем компрессии.

Вегетативные эффекты. Наиболее часто проводится оценка изменений величины зрачка, отверстия глаза, образуемого мигательной перепонкой, и экзофтальма (рис. 3). Эти параметры служат для выявления действия исследуемых веществ главным образом на вегетативную нервную систему. Оценивается влияние веществ на саливацию, взъерошивание, тонус сосудов уха (цвет кожи) и частоту дыхания и сердечных сокращений. Последние целесообразно регистрировать с помощью электрокардиографа.

 

 

Рис. 3. Динамика положения мигательной перепонки у кошки при фармакологических воздействиях (Green е. а., 1964): А – интактная кошка; Б – действие адреноблокаторов; В – эффект ганглиоблокаторов; Г – действие атропина.

 

Влияние веществ на обменные процессы и терморегуляцию исследуют путем термометрии, которую осуществляют термисторным термометром, вводимым в прямую кишку на глубину 15—19 мм. При необходимости проводится изучение влияния исследуемых веществ на диурез спредварительной водной нагрузкой и регистрацией количества мочи в воронкообразном коллекторе.

Характеристика терминальной стадии интоксикации. Отмечаются острая летальность и смертельные исходы со значительным латентным периодом. Картина отравления может давать определенное представление (в комплексе с другими тестами) о характере действия исследуемого вещества. Сердечные гликозиды, например, вызывают рвоту и в терминальной стадии действия последовательно — остановку сердца и дыхания; аналептики —судороги при сравнительно низкой токсичности, инсулиноподобные вещества и гепатотропные средства могут вызывать смерть после периода от носительного благополучия и т. д.

Патологоанатомические данные представляют большую ценность для суждения о характере изменений сосудистой стенки, сосудистого регионарного тонуса и т. д. С этой целью особое внимание обращается на наличие геморрагии, особенности кровенапол­нения органов, изменения печени и некоторые другие патолого-анатоми-ческие данные, специфические для дей­ствия того или иного препарата. Методика исследования экспериментальных животных и оценка патолого-анатоми-ческих изменений подробно представлены в ряде специальных работ, посвященных этому вопросу (Zbinden, 1963, и др.). Определенный интерес при оценке органотропности токсического действия препарата могут представлять относи­тельные изменения веса внутренних органов животных и данные их. гистологических и гистохимических иссле­дований (табл. 3). Более ценная инфор­мация о характере общего действия фармакологических средств может быть получена при проведении экспериментов на кошках, которые по характеру физиологических реакций стоят значительно ближе к человеку. Обычно для наблюдения используется группа животных, состоящая из 4 кошек. После 20 минут адаптации животные находятся под наблюдением в течение часа до введения препарата и в течение 5 часов после введения. На протяжении 15 минут каждого часа отмечают особенности поведения животного и в течение последующих 15 минут исследуют пара­метры функционального состояния животных. В качестве тестов используют параметры, указанные в схеме исследования общей активности и токсичности веществ на мышах, и такие дополнительные показатели, как общение между животными, реакция на дистантные раздражители и некоторые другие, связанные с вероятным профилем действия исследуемого вещества. Схема исследования средств, влияющих на высшую нервную деятельность в экспериментах на кошках, подробно описана в одной из работ Irwin (1964).

Данные наблюдений за функциональным состоянием интактных животных дополняются рядом тестов на изолированных органах, которые приведены в схеме.

 

 

Схема изучения некоторых видов физиологической активности исследуемых веществ на изолированных органах

 

 

В табл. 4 представлены наиболее часто обнаруживаемые комплексы эффектов, дающие общее представление об активности, характерной для определенных фармакологических групп лекарственных веществ по материалам наблюдений на интактных мышах и изолированных органах. Необходимо, однако, отметить, что указанные в табл. 4 признаки биологической активности различных фармакологических веществ имеют сугубо ориентировочное значение и представляют определенный интерес лишь на первом этапе скриннинга.

 

 

Таблица 4

ДАННЫЕ ПЕРВИЧНОГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ, ХАРАКТЕРНЫЕ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ГРУПП ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

 

 

 

 

Примечание. Знаками + и – обозначены соответственно повышение и торможение эффектов, представленных в табл. 1 и табл. 4.

 

Важно подчеркнуть, что систематизация некоторых проявлений активности, свойственной для определенных групп лекарственных веществ, не отражает многообразия фармакодинамических эффектов, характерных для от­дельных представителей, часто имеющих специфический механизм действия. Так, например, механизм действия центральных депрессантов настолько разнообразен, что в связи с этим не представляется возможным изучение на начальном этапе исследования всех, даже наиболее важных форм активности этих соединений. Кроме того, представленные в систематизированной форме данные первичного фармакологического исследования могут указывать в основном на активность и сходство исследуемых веществ с препаратами, фармакодинамика которых хорошо изучена. Вещества с неизвестным механизмом действия могут, естественно, оставаться вне поля зрения наблюдателя. На начальном этапе фармакологического исследования совершенно не выявляются вещества с высокой избирательной активностью, такие, как антихоле­стериновые препараты, антикоагулянты непрямого действия и многие другие. Для их обнаружения необходимо включение дополнительных специальных тестов. Кроме того, для завершения первичного фармакологического исследования представляется целесообразным использование моделей патологических состояний, ибо на интактных животных эффект ряда ценных лекарственных веществ (жаропонижающие, антиаритмические, противогистаминные и др.) не может быть обнаружен.

Предварительное заключение об активности препарата, базирующееся на результатах первичного фармакологического исследования, подтверждается или отклоняется в процессе дальнейшего углубленного фармакологического исследования с помощью более специализированных методик.

Рассматривая используемые в настоящее время стандартные методы первичного фармакологического исследования как основную базу для выявления новых лекарственных средств, следует признать, что они не вполне удовлетворяют исследователя ни глубиной, ни возможностями применяемых методик, поэтому разработка новых, пусть даже технически сложных, но быстро выполнимых методик представляется важным направлением дальней­шего совершенствования отбора новых лекарственных веществ. С этой точки зрения особого внимания заслуживают такие методики, как электробаллистокардиография, электроэнцефалография, а также технические средства программирования и автоматизации экспериментов и т. д. Совершенно естественно, что в процессе первичного фармакологического исследования и отбора лекарственных веществ важную роль играет квалифицированная интерпретация получаемых на этом этапе данных, требующая фундаментальных знаний фармакологии в целом.