Виконати лабораторні роботи:
ЗАВДАННЯ 1. Приготувати витяжку з рослинної сировини.
Об'єкти аналізу: корені солодки голої, синюхи голубої, кореневище діоскореї, трава астрагалу шерстистоквіткового, хвоща польового, плоди кінського каштану.
Методичні вказівки. 2 г подрібненої рослинної сировини залийте 40 мл гарячого ізотонічного розчину хлориду натрію і нагрійте на киплячій водяній бані протягом 15 хв. Після охолодження профільтруйте.
ЗАВДАННЯ 2. Провести визначення сапонінів у витяжці за допомогою реакцій ідентифікації і хроматографічним методом.
Методичні вказівки.
І. Визначення сапонінів на основі фізичних властивостей. 3 мл витяжки інтенсивно струшуйте на протязі кількох секунд. При наявності сапонінів утворюється піна. З допомогою проби піноутворення визначте хімічну природу сапонінів, для чого її проведіть одночасно в кислому і лужному середовищах (реакція Фонтан-Кандела): у дві пробірки однакового кольору і діаметру внесіть по 2 мл досліджуваної витяжки, в одну пробірку додайте 2 мл 0,5 % хлористоводневої кислоти (рН 1), а в другу – 2 мл 0,5 % розчину натрію гідроксиду (рН 13), після чого в обидві пробірки через капіляри продуйте повітрям і відмітьте висоту піноутворення і стійкість піни. У протоколі вкажіть умови кращого піноутворення (рН середовища) і зробіть висновок про належність сапонінів до групи тритерпенових або стероїдних сполук.
ІІ. Визначення сапонінів на основі хімічних властивостей.
а) Реакції осадження:
1. до 2 мл водної витяжки додайте кілька краплин ацетату свинцю, зафіксуйте результат реакції;
2. 2 мл витяжки випаруйте у фарфоровій чашці, сухий залишок розчиніть у 1 мл етилового спирту і додайте кілька краплин 1 % спиртового розчину холестерину. Відмітьте результат реакції;
3. до 2 мл водної витяжки додайте декілька краплин реактиву Неслера, зафіксуйте одержаний результат;
4. до 2 мл водної витяжки додайте декілька краплин насиченого розчину барію гідроксиду, опишіть результат реакції.
б) Реакції утворення забарвлених речовин:
1. реакція Лафона. 2 мл витяжки випаруйте в фарфоровій чашці, залишок розчиніть у суміші рівних частин концентрованої сірчаної кислоти й етанолу при нагріванні (спостерігається жовте забарвлення). Додайте 1 краплину 10 % розчину сульфату заліза (ІІ) і зафіксуйте результати реакції;
2. до 2 мл витяжки додайте 1 мл 10 % розчину нітрату натрію і 1 краплину концентрованої сірчаної кислоти. Вкажіть результат реакції;
3. Реакція Лібермана-Бурхарда. 2 мл витяжки випаруйте у фарфоровій чашці, залишок розчиніть у 0,5 мл оцтового ангідриду і перенесіть у пробірку. По стінках пробірки обережно долийте рівний об'єм концентрованої сірчаної кислоти. Результати реакції спостерігайте на границі шарів.
За результатами хімічних реакцій зробіть висновок про наявність сапонінів у ЛРС.
ІІІ. Визначення сапонінів на основі біологічних властивостей.
До 2 мл витяжки додайте 2 мл 2 % суспензії еритроцитів баранячої крові в ізотонічному розчині хлориду натрію. Результати реакції спостерігайте через 10-15 хв. У протоколі вкажіть характер продукту реакції (наявність або відсутність осаду, забарвлення розчину) і поясніть суть змін, які відбулися.
ІV. Визначення сапонінів методом хроматографії.
2 мл витяжки внесіть у фарфорову чашку і випаруйте на водяній бані. Сухий залишок розчиніть у 1 мл 70 % етанолу і одержаний розчин нанесіть капіляром на стартову лінію пластинки з закріпленим шаром сорбенту. Паралельно нанесіть розчин сапоніну - "свідка". Підсушену пластинку внесіть в камеру, заповнену системою розчинників: хлороформ - ацетон - вода (4:32:7). Після розвитку хроматограми висушену в термостаті при 50-60°С пластинку обробіть 10 % спиртовим розчином сірчаної кислоти, після чого помістіть у термостат на 5-10 хв (температура 30-50°С) для проявлення плям і порівняйте їх Rf з величинами Rf "свідків". Результати досліду внесіть до протоколу.
ЗАВДАННЯ 3. Визначити кількісний вміст сапонінів у лікарській рослинній сировині.
Методичні вказівки. Для кількісного визначення сапонінів у лікарській рослинній сировині використовують методи, які базуються на використанні біологічних та інших властивостей цих речовин, а також вагові і фізико-хімічні (фотометричні). Найбільш широко прийнятим з біологічних методів є визначення гемолітичного індексу, величина, якого прямо пропорційна кількості речовини в розчині (непрямий метод).
