Когда бактериальные клетки достигают определенных размеров, они переходят к бесполому размножению, которое называется простым делением; при этом клетка делится на две идентичные дочерние клетки. Если одиночную бактерию поместить в питательную среду в оптимальных условиях роста, то она и ее потомки будут делиться каждые 30 мин.
В идеальных условиях рост бактерий является экспоненциальным. При экспоненциальном росте время, которое требуется для удвоения числа бактерий, постоянно. Оно называется временем удвоения, или временем генерации. Идеальную модель роста популяции бактерий можно сравнить с ростом реальной популяции в закрытом сосуде, где нет внешних воздействий, например не добавляются питательные вещества. Графическое отображение численности жизнеспособных бактерий имеет четыре фазы. Первая – это лаг-фаза, в ходе которой бактерии адаптируются к новой среде обитания, и максимальная скорость роста не достигается. В этот период в клетках бактерий могут, например, синтезироваться новые ферменты, необходимые для усвоения тех питательных веществ, которые присутствуют в новой среде.
Следующая фаза роста популяции бактерий – логарифмическая, когда бактерии растут с максимальной скоростью, число бактерий увеличивается почти экспоненциально, т. е. кривая роста представляет собой почти прямую линию. В ходе этой фазы время удвоения остается постоянным и имеет минимальное значение.
Со временем рост колонии начинает замедляться, время удвоения начинает увеличиваться, и культура входит в стационарную фазу, когда скорость роста популяции равна нулю и когда резко возрастает конкуренция за пищевые ресурсы. Образование новых клеток замедляется и затем совсем прекращается. Любое увеличение числа клеток компенсируется одновременной гибелью других клеток, поэтому суммарная численность живых клеток остается постоянной. Переход к этой фазе определяется действием ряда факторов: истощением необходимых питательных веществ, накоплением токсичных продуктов распада, таких как спирт, а в случае аэробных бактерий еще и ограничением доступа кислорода. Рост бактерий замедляется также при изменении рН.
Во время последней фазы – фазы замедления роста – возрастает скорость гибели клеток, и она становится выше, чем скорость размножения. Со временем клетки вообще прекращают воспроизводиться. Те же принципы применимы к росту любых популяций, даже популяций человека. Теоретически любая популяция может достичь экспоненциального роста, если время удвоения остается постоянным. Однако в действительности, рано или поздно в дело вступают лимитирующие факторы и изменяют темпы роста популяции.
Рост бактерий не всегда сопровождается делением. Многие факторы - детергенты, антибиотики, соли жёлчных кислот, УФ-облучение – задерживают деление клеток. В результате образуются длинные нитевидные формы, значительно превышающие по размерам исходные клетки.
Оценка роста бактерий.
Прямые методы.
Подсчет микроорганизмов можно проводить непосредственно под микроскопом с использованием различных счётных камер (например, Петрова-Хаузера или Горяева) или на мембранных фильтрах (этим методом учитывается общее число живых и мертвых клеток).
Подсчет клеток в счетной камере Горяева-Тома. Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий.
Устройство счетной камерой Горяева. Камера представляющей собой толстое предметное стекло с нанесенными на него поперечными прорезями, которые образуют три поперечно расположенные площадки. Средняя из них разделена на две части, на каждой из которых выгравирована сетка (рисунок 25, 26) площадью 9 мм2, разделенная на 225 больших квадратов площадью 0,04 мм2 каждый (15 рядов по 15 квадратов) и 400 малых квадратов площадью 0,0025 мм2 каждый (каждый третий ряд больших квадратов в горизонтальном и вертикальном направлении разделен на 16 малых квадратов). Средняя площадка предметного стекла опущена на 0,1 мм относительно двух других площадок, на которые накладывают специальное шлифованное покровное стекло размером 18×18 мм, что обеспечивает создание камеры для дрожжевой суспензии.
Рисунок 25 – Камера Горяева: 1 – предметное стекло; 2 – специальное покровное стекло; 3 – камера для дрожжевой суспензии; 4, 6 – площадка для покровного стекла; 5 - сетка для подсчета дрожжевых клеток; 7 – прорезь для введения дрожжевой суспензии
Количество клеток определяют в соответствии с формулой О = А × К1 × К2 × В, где В количество клеток в 1 мл суспензии, шт/мл; А количество клеток в 80 малых квадратах, шт.; К., коэффициент глубины камеры (при глубине камеры 0,1 мм К1 = 10; при глубине камеры 0,2 мм К1 = 5); К2 -коэффициент пересчета объема, 1/мл (К2 = 5000 1/ мл); В - коэффициент разбавления пробы (для дрожжей В =10).
При подсчете дрожжевых клеток в камере Горяева с глубиной 0,1 мм и десятикратным разбавлением дрожжевой суспензии В = 5 × 104 А × В.
В зрелых дрожжах и сбраживаемом сусле (во время главного брожения) количество дрожжевых клеток превышает 80 млн шт./мл.
Рисунок 26 – Сетка для подсчета дрожжевых клеток в камере Горяева: 1 – большой квадрат; 2 – малый квадрат
При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Эти кольца указывают на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3 - 5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5 %-ном водном растворе формалина.
1) Число клеток подсчитывают с объективом 8× или 40×. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом – 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600. Подсчет клеток повторяют 3-4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:
А 103
М = ------------ n,
h S
где:
М – число клеток в 1 мл суспензии;
А – среднее число клеток в 1 квадрате сетки;
h – высота камеры, мм;
S - площадь 1 квадрата сетки, мм2;
103 - коэффициент перевода кубических сантиметров в кубические миллиметры;
n – разведение исследуемой суспензии.
2) Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида). Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет можно проводить в удобное для исследователя время. Для этого хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 или 6 см2. Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объем исследуемой суспензии (0,01, 0,02 или 0,03 мл) и каплю 0,03-0,1%-ного водного раствора агара.
Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют 10-20 мин 96 %-ным спиртом и окрашивают 1-2 мин фуксином Циля или любым другим красителем. Краситель сливают, препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4-5 стаканов с водой (промывать препарат под струѐй водопроводной воды не следует), и высушивают на воздухе. В таком виде препараты хорошо сохраняются.
3) Подсчет клеток на мембранных фильтрах. Этот метод применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях.
Фильтрование пробы определенного объема (от нескольких миллилитров до десятков литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.
4) Подсчет колоний на чашках Петри с питательной средой. Здесь определяется только число жизнеспособных клеток, которые на питательной среде образовали колонии. Количество живых клеток определяют, подсчитывая выросшие на твёрдой питательной среде бактериальные колонии. При этом учитывают разбавление бактериальной суспензии, сделанное при посеве.
5) Количественную оценку роста обычно проводят в жидких средах, где растущие бактерии образуют гомогенную суспензию. Увеличение количества клеток устанавливают, определяя концентрацию бактерий в 1 мл, либо определяют увеличение клеточной массы в весовых единицах, отнесённых к единице объёма.
Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа. Чтобы результат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать в 50-100 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата, вычисляют по формуле:
AS
М = ---- n,
sV
где:
М – количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;
А – среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);
s – площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мкм2;
V – объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
S – площадь приготовленного мазка, мкм;
n – разведение исследуемого субстрата.
Косвенными методами считаются:
1) Фотометрические методы измерения мутности бактериальной суспензии основаны на её способности поглощать либо рассеивать свет пропорционально количеству бактерий; эти методы широко применяются на практике. Важно помнить, что линейная зависимость между мутностью суспензии и бактериальной массой наблюдается только при низких плотностях клеточных суспензий. Чтобы правильно измерить количество микроорганизмов в культуре с высокой плотностью, нужно сделать соответствующее разведение образца.
2) Учет бактериальной массы взвешиванием или по содержанию общего азота.
Прирост биомассы бактерий оценивают после осаждения центрифугированием известного объёма питательной среды с последующим определением массы осадка (так называемый «сырой вес»). Сухой вес определяют, измеряя массу осадка, высушенного при 100 ºС.
Биохимические методы определения биомассы основаны на определении общего азота в клетках (метод Кьельдаля), общего углерода (по ван Слайку-Фолчу), общего белка (по Лоури или Фолину), поскольку в бактериальной клетке элементный состав довольно стабилен.
3) Подсчёт с использованием автоматических счётчиков, регистрирующих отрицательный заряд поверхности каждой микробной клетки, основан на снижении проводимости раствора электролита при прохождении одной бактерии через узкое отверстие. Недостаток метода заключается в том, что любая частица (немикробная клетка) или несколько слипшихся частиц дают при подсчёте одинаковый результат.
4) В тех случаях, когда плотность клеточной суспензии очень мала, можно использовать иные биохимические подходы (например, измерять поглощение кислорода, образование С02 или кислот).
5) Для определения количества клеток анаэробных микроорганизмов чашки Петри после посева помещают в анаэростат. Иногда для определения численности анаэробов плотную среду после засева оставляют в пробирках. Поверхность застывшей среды заливают парафином. Для лучшего учета колоний микроорганизмов среды в этом случае рекомендуется осветлять. Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1-15 сут. инкубации. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри делят на секторы, просчитывают колонии в каждом секторе и суммируют результаты. Иногда для подсчета колоний используют специальные полуавтоматические счетчики.
Лучшим разведением следует считать то, из которого при высеве в чашке Петри вырастает от 30-50 до 100-150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты для расчета количества клеток в исходном материале не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из разведения на одной чашке.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле
M=a*10n/V,
где:
М – количество клеток в 1 мл;
а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V – объем суспензии, взятый для посева, мл;
10 n – коэффициент разведения.
Вопросы для обсуждения
1. Каким образом прикрепляют бактериальные культуры на предметном стекле?
2. С какой целью фиксируют микробиологические препараты?
3. Чем объясняется различие окраски бактерий при окрашивании по Граму?
4. Какие красители дают фиолетовую окраску, а какие розовую?
5. Как называется фаза наиболее интенсивного роста популяций бактерий?
6. Какие причины снижают темпы роста популяций бактерий?
7. Какое свойство бактерий позволяет определять их численность в колониях по общему азоту?
8. Какое число колоний необходимо для определения численности бактерий?
9. Чем определяется методы подсчета численности бактерий?
