Бактериоскопическое исследование.

Бактериоскопическое исследование и оценка качества ры­бы осуществляются следующим образом.

1 Поверхность спины рыбы освобождают от чешуи, после чего это место прижигают раскаленным на пламени горелки но­жом или шпателем и стерильным скальпелем посредине спины делают разрез.

2 Пинцетом расширяют разрез и ножницами вырезают на глубине 1-1,5 см кусочек мякоти площадью примерно 2 см². Этот кусочек прикладывают к предметному стеклу (стекло должно быть обожжено на пламени спиртовки и охлаждено).

3 Отпечаток на стекле подсушивают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают по Граму или метиленовым синим.

Можно пользоваться другим способом.

1 Поверхность рыбы на месте взятия пробы прижигают рас­каленным на пламени шпателем или ножом и разрезают стериль­ным скальпелем.

2 На глубину 1,5-2 см разреза помещают подго­товленное предметное стекло. Разрез зажимают стерильным пин­цетом.

3 Стекло извлекают, отпечаток с одной стороны стирают ватой, смоченной спиртом, с другой фиксируют, окраши­вают и микроскопируют с иммерсионным объективом.

4 Отмечают форму и количество микробов.

Микрокартину регистрируют следующим образом:

– отсутствие микробов   в препарате; 

– единичные экземпляры в препарате;       

– единичные в поле зрения;

– множество организмов в поле зрения.

Для получения отпечатка с поверхности рыбы, место, предназначенное для исследования, не прижигают. К нему при­кладывают предметное стекло, препарат подсушивают и окраши­вают по Граму.

Часто отпечаток с поверхности пробы имеет округлые тем­ные зерна пигмента, схожие с кокками.

Бактериоскопические и бактериологические методы оцен­ки качества применяются и при определении качества мороженой рыбы.

Оценку качества рыбы проводят по бактериологическим показате­лям, представленным в таблице 4.

 

Таблица 4 – Оценка качества рыбы

Методы исследования	Свежая рыба	Рыба небольшой давности улова, но допустимая к употреблению	Рыба испорченная и не пригодная к употреблению
Бактериоскопия поверхности пробы	Единичные микробы в мазке или в поле зрен-ия	Единичные микробы (5 - 6) в поле зрения	40 и более клеток в поле зрения
Бактериоскопия глубинного слоя мышц	Микрофлора не обна-ружена	Единичные микробы в препарате	От 10 до 20 и более клеток в поле зрения
Посев на чашки с питательным агаром:
а) степень обсемененности микробами с температурным оптимумом 20 °С	От единичных коло-ний до рассеянного их роста	От рассеянного роста колоний до обильного	От сплошного роста колоний до обильно-го
б) степень обсемененности микробами с температурным оптимумом 37 °С	Рост колоний отсут-ствует или видны еди-ничные колонии	От единичных колоний до слабо рассеянного их роста	От единичных коло-ний до сплошного их роста
в) реакции по лакмусу	Слабокислая реакция, рН 6,8-6,4	Кислая реакция, рН 6,4-6,0	Кислая реакция, рН 6,5 или слабоще-лочная, рН более 7,0, но может быть в пределах нормы

 

Вопросы для обсуждения.

1 Чем отличается техника получения образца при исследовании обсемененности поверхности рыбы и ее внутренних тканей и органов?

2 Какие группы организмов могут быть обнаружены при микробиологическом исследовании рыбы?

3 Назовите причины и источники микробиального заражения рыбы.

Лабораторная работа № 14. Микроскопические грибы

Цель работы. Изучить особенности строения низших грибов, их систематику, познакомиться с грибковыми заболеваниями рыб.

Задание. Приготовить препарат плесневых грибов, изучить под микроскопом и зарисовать грибы рода мукор и пеницилл.

Теоретическая часть

Грибы – низшие эукариотические одноклеточные и мицелиальные хемоорганотрофные организмы. Их относят к особо­му царству живых существ – Mycota.

Представители грибов делятся на макро- и микромицеты. Макромицеты образуют крупные плодовые тела, отсутствующие у микромицетов. У последних на протяжении всего жизненного цикла имеются только микроскопические структуры.

Большинство грибов – организмы с вегетативной струк­турой, называемой мицелием. Мицелий состоит из многоядерной массы цитоплазмы, наполняющей сильно разветвленную систему жестких трубочек примерно одинаковой толщины (~5 мкм). Обычно мицелий образуется при прорастании и разрастании оди­ночной репродуктивной клетки-споры.

Грибная спора дает длинную нить или гифу, которая, уд­линяясь, многократно ветвится и образует целую систему нитей, т.е. мицелий. Рост грибов осуществляется за счет кончиков гиф и может продолжаться до тех пор, пока хватает питательных ве­ществ; у некоторых грибов мицелий может занимать участок поч­вы до 15 м в диаметре.

Мицелий грибов может быть одноклеточным (несептированным) и многоклеточным (септированным). Грибы могут раз­множаться вегетативным, бесполым и половым путем. Грибы рас­пространены в природе повсеместно. Споры грибов обнаружива­ются в любых экосистемах, техногенных потоках и продуктах. Наибольшее количество грибов встречается в почве. Они прини­мают активное участие в биогеохимическом цикле превращений углерода в природе.

Среди большого разнообразия грибов, приспособившихся к жизни в почве, имеется небольшая группа водных грибов, а также довольно обширная группа паразитических грибов, вызы­вающих заболевания человека, животных и растений (микозы).

Грибы способны выделять во внешнюю среду ферменты и путем абсорбции поглощают питательные вещества, продукты ферментативного гидролиза природных биополимеров и других растворимых веществ. Такой тип питания определяет положение почвенных грибов как самую крупную экологическую группу, уча­ствующую в минерализации органических веществ в экосистемах.

К царству Mycota (или Fungi) относятся миксомицеты (ис­тинные слизевики) и эумицеты (истинные грибы).

Среди эумицетов различают низшие грибы фикомицеты (или зигомицеты) и высшие грибы, которые распределены по классам: аскомицеты, базидиомицеты и несовершенные грибы.

Зигомицеты (низшие грибы) имеют хорошо развитый несептированный мицелий. Отсутствие перегородок в мицелии оп­ределяет его многоядерность (ценоцитный мицелий).

Типичный представитель фикомицетов Mucor pusillus раз­вивается в виде войлоковидного налета серого цвета. Его мице­лий образует структуры двух типов – разветвленные гифы (ри­зоиды), проникающие в субстрат, и поднимающиеся вверх над пучками ризоидов особые воздушные гифы – спорангиеносцы, расширяющиеся на верхушке, образуя округлый спорангий. Спорангий отделяется перегородкой от остальной части спорангиеносца. Внутри спорангия развивается большое количе­ство сферических эндоспор, служащих для размножения. Это бес­полый способ размножения (рисунок 27).

У зигомицетов существует и половой способ размножения, сопровождающийся образованием зигоспор.

У гомоталлических форм зигомицетов зигоспоры образу­ются в результате слияния половых клеток, формирующихся на одном и том же мицелии. У гетероталлических форм различают два вида мицелия, не отличающихся морфологически и обозначаемых как (+) и (-).

Зигоспоры образуются только при контакте гиф (+) с ги­фами (-). При прорастании зигоспоры происходит мейоз и появ­ляется гифа, образующая спорангий (рисунок 28).

Аскомицеты (высшие грибы) имеют многоклеточный вет­вящийся мицелий. Клеточные перегородки пронизаны порами, что обусловливает «ценоцитную» природу цитоплазмы. У аскомицетов различают два способа размножения: половой и бесполый. При половом способе слияние двух ядер приводит к образованию зиготы, которая превращается в аск (сумку), внутри него (аска) в результате деления диплоидного ядра образуются гаплоидные аскоспоры, их может быть от четырех до 1000 и более.

Рисунок 27 – Грибы: 1 – p. Mucor; 2 – p. Aspergillus; 3 – p. Penicillium; 4 – p. Fusarium; 5 – p. Oidium; 6 – p. Saccharomyces; 7 – p. Schizosaccharomyces; 8 – p. Saccharomycoides; 9 – p. Candida

При бесполом способе размножения на концах плодонося­щих гиф - конидиеносцах - образуются экзоспоры (конидии). К аскомицетам относятся многие виды плесневых грибов и дрожжей.

 

Рисунок 28 – Структура тела грибов: а – половые структуры грибов 1 – зигоспора; 2 – сумки; 3 – базидии; б – структура мицелия и септовых пор: 1 – несептированный мицелий зигомицетов; 2 – септы с простыми порами аскомицетов; 3 – пряжковый мицелий и септы с долипорами базидиомицетов; 4 – почкующиеся клетки и псевдомицелий дрожжей

 

Шизосахаромицеты (род Sthizosaccharomyces) размножа­ются делением. При вегетативном способе размножения почки образуются только полярно, по концам клетки, причем отделение почки сопровождается образованием перегородки между нею и материнской клеткой. Такие дрожжи используют при производст­ве некоторых сортов пива.

Базидиомицеты – наиболее высокоразвитая группа гри­бов, объединяющая все шляпочные грибы. Органы спороношения (базидии) – клетки на концах гиф, содержат, как правило, четы­ре гаплоидных базидиоспоры, отделяющиеся от базидии путем отшнуровывания. Мицелий базидиомицетов многоклеточный, многоядерный, отличить его от мицелия аскомицетов можно по наличию пряжек – особых мицелиальных отростков крючкооб­разной формы, располагающихся над клеточными перегородками. Возникновение пряжек у базидиомицетов сопровождает процесс деления ядер и клеток.

Дейтеромицеты (несовершенные грибы) – большая груп­па грибов, включающая как одноклеточные (дрожжи), так и мно­гоклеточные мицелиальные формы. Общим для всех грибов этого класса является отсутствие половой стадии при размножении. Из одноклеточных дейтеромицетов дрожжи рода Candida широко применяются в микробиологической промышленности. Они ис­пользуются при получении белково-витаминного препарата, ор­ганических кислот, многоатомных спиртов; представители этого рода участвуют в очистке сточных вод, являясь компонентами активного ила, в очистке почвы и речной воды от нефтяных за­грязнений.

Дрожжи p. Candida размножаются многосторонним почко­ванием, большинство видов образуют псевдомицелий.

Псевдомицелий часто подразделяют на псевдогифы и бластоспоры. Бластоспорами у дрожжей называют вегетативные спо­ры, образующиеся почкованием на псевдомицелии. Они обычно круглой или овальной формы и располагаются по отношению к псевдомицелиальным клеткам в определенном порядке, образуя или цепочки, или мутовки.

К несовершенным грибам относятся также широко рас­пространенные в природе виды дрожжей p. Rhodoturula, отли­чающиеся желтой или красной окраской за счет содержания каротиноидов. Их применяют для обогащения полученной биомассы провитамином А.

К многоклеточным дейтеромицетам относятся виды p. Fusarium, p. Oidium и др. Большинство представителей этих грибов являются фитопатогенными.

Род Fusarium отличается серповидно изогнутыми много­клеточными конидиями, которые развиваются на коротких раз­ветвленных конидиеносцах.

Род Oidium характеризуется наличием сильно разветвлен­ного мицелия, гифы которого легко распадаются на оидии – от­дельные клетки, служащие для размножения. Один из представи­телей этого рода – Oidium lactis (или молочная плесень), часто встречается в виде бархатистой пленки на поверхности кисломо­лочных продуктов, вызывая их порчу.

Болезни рыб, вызываемые патогенными грибами, обуслов­ливают массовую гибель рыб. Особенно значительную опасность они представляют в условиях интенсификации рыбоводства.

Наибольшую угрозу для прудовых рыбоводных хозяйств представляют такие широко распространенные болезни, как бранхиомикоз, сапролегниоз, ихитоспоридиоз и др.

Бранхиомикоз – острозаразная болезнь рыб различных ви­дов, характеризующаяся поражением кровеносных сосудов жабер­ного аппарата и некротическим распадом жаберной ткани. Возбуди­телем бранхиомикоза у карпа, сазана, карася является гриб – В r а n chiomyces sanguinis. Это специфический паразит крови. Гифы гриба сильно разветвлены, толщина их 8-30 мкм, длина 10-15 мкм. В вегетативном состоянии они обычно тоньше, при образовании спор утолщаются. Сильно разветвленные гифы гриба находятся только в кровеносных сосудах жаберных дуг, жаберных лепестков и ды­хательных складок. В соединительной ткани рост этого гриба пре­кращается.

Больная бранхиомикозом рыба не берет корм, не реагирует на внешние раздражители, подплывает к поверхности воды, но не заглатывает воздух, как при заморе. Сильно пораженная рыба ле­жит на боку, и в таком положении погибает.

Сапролегниоз – микозная, как правило, секундарная бо­лезнь пресноводных рыб различных видов, характеризующаяся поражением кожи, плавников и жаберного аппарата условнопатогенными грибами. Часто сапролегниоз проявляется на фоне дру­гих инвазионных и инфекционных болезней. Возбудители этой болезни – низшие грибы (фикомицеты) рода Saprolegnia. Грибы имеют разветвляющиеся и неразветвляющиеся гифы, лишенные перегородок. Толщина гиф колеблется от 20 до 75 мкм. Гифы окру­жены оболочкой и заполнены протоплазмой, содержащей многочис­ленные ядра. Терминальная часть гифа расширена и образует спо­рангий, в котором находятся зооспоры. После созревания спор спо­рангий разрывается, и зооспоры рассеиваются во внешний среде.

В начальной стадии болезни на коже, плавниках или жаб­рах появляются белые тонкие нити, перпендикулярно отходящие от поверхности тела рыбы. Разрастаясь на поверхности тела больных рыб, возбудитель сапролегниоза образует мощно разви­тый пушистый и ватообразный мицелий белого или желтоватого цвета. При устранении причины и улучшении режима содержания и кормления рыб, а также проведения санитарных мероприятий рыба выздоравливает, но резко ослабленные особи погибают.

 

Вопросы для обсуждения.

1 Каково строение грибов?

2 Какова структура тела грибов?