Лабораторная работа № 12. Исследование микрофлоры почвы

 

Цель работы. Изучение основных методов исследования микрофлоры почвы.

Задание. Определить содержание микроорганизмов в почве улицы.

 

Ход работы.

Населяющие почву многочисленные популяции и группы популяций разнообразных организмов, различающиеся по эколо­гическим функциям и таксономическому положению, объединя­ются общим понятием «почвенная биота».

Почва является средой обитания большого числа разнооб­разных микроорганизмов. В 1 г почвы содержится от 1 до 10 млрд клеток микроорганизмов. В почве активно протекают процессы разложения органических природных веществ, при участии широ­кого разнообразия сапрофитных микроорганизмов.

Для выявления, изучения и учета численности почвенных микроорганизмов используют прямые методы микроскопирования и методы посева из разведений почвенной суспензии на плотные и жидкие среды.

Для прямого микроскопического изучения почвы приме­няется метод Виноградского в различных модификациях. Суть его заключается в том, что почвенную суспензию, нанесенную на предметное стекло, фиксируют и окрашивают карболовым эритрозином. Окрашенные клетки просчитывают под микроскопом.

Несмотря на то, что методы прямого микроскопирования позволяют выявить и учесть значительно большее количество микроорганизмов (число бактерий, учитываемых прямыми мето­дами, в тысячу раз превышает то, которое учитывается методом посева), метод посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных микроорганизмов. Он позволя­ет не только учитывать количество, но и групповой (а часто и видовой) состав микрофлоры. Используя этот метод посева, мож­но из изолированных колоний, выросших на чашках, выделять микроорганизмы в чистые культуры для дальнейшего исследова­ния и идентификации.

Отбор и подготовка почвенного образца дли микробиоло­гического анализа.

При отборе образцов почвы учитывают чрезвычайную макро-, мезо- и микрогетерогенность как микробиологических показателей почвы, так и других ее свойств. С пробной площадки отбирают 3-10 образцов и анализируют их отдельно. Это позво­ляет получить статистически достоверные результаты о среднем количестве микроорганизмов, а также дает возможность судить о разнообразии и степени разброса полученных данных.

Образцы почв для микробиологических исследований от­бирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые па­кеты или стеклянную посуду с ватными пробками и др.

При отсутствии возможности анализировать образцы непо­средственно после их

сбора в течение нескольких часов высушива­ют на воздухе, предохраняя от прямых солнечных лучей.

При подготовке почв к микробиологическому анализу необ­ходимо провести следующие операции:

– разрушить почвенные агрегаты;

– десорбировать микроорганизмы с поверхности почвен­ных частиц;

– выделить из органоминерального геля и дезагрегировать микроколонии микроорганизмов.

Для разрушения почвенных агрегатов чаше всего исполь­зуют метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 мин в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.

Используют также метод обработки почвенной суспензии на электрической мешалке или на ультразвуковой установке.

Перед посевом влажную или сухую почву высыпают на часовое стекло, протертое спиртом, и освобождают от посторон­них включений.

Техника посева

1 Навеску подготовленной почвы в 1 г переносят в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды.

2 Готовят разведения почвенной суспензии, для чего 1 мл суспензии из колбы последовательно переносят в ряд пробирок с 10 мл стерильной водопроводной воды.

3 Посев на плотные среды производится из разных разведе­ний. Разведение для высева подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50-200 колоний.

4 Из каждого образца берут не менее трех повторных наве­сок и каждую высевают не менее чем на трех чашках.

5 На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят каплю почвенной суспензии определенного разведения и с по­мощью стеклянного шпателя распределяют ее по всему агару.

Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помеща­ют в термостат. Сроки учета микроорганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов. На МПА обычно, на 2-3 сут инкубации учитывают споровые и неспо­ровые формы бактерий. На среде Чапека на 5-7-е сут учитывают колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5-7-е сут – колонии грибов и дрожжей.

Подсчет количества колоний на чашке проводят обычно со дна чашки в проходящем свете. На месте подсчитанной коло­нии чернилами по стеклу или маркером ставится точка.

Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вычисляют их среднее число на одной чашке и затем делают пересчет для определения содержания микроорганизмов в 1 г почвы по формуле:

 

а = б • в • г,

где

а – количество клеток в 1 г почвы;

б – среднее количество колоний на чашке;

в – разведение, из которого сделан посев; г- количество капель в 1 мл суспензии.

Результаты обрабатывают статистически, рассчитывают ошибку среднего арифметического, среднее квадратичное откло­нение и коэффициент вариации.

 

Вопросы для обсуждения.

1. Какие группы микроорганизмов исследуют в пробах почвы?

2. Какое время необходимо для проведения микробиологического анализа почвы?

3. В каком объеме почвы принято учитывать концентрацию микроорганизмов?