Цель работы. Изучение основных методов исследования микрофлоры почвы.
Задание. Определить содержание микроорганизмов в почве улицы.
Ход работы.
Населяющие почву многочисленные популяции и группы популяций разнообразных организмов, различающиеся по экологическим функциям и таксономическому положению, объединяются общим понятием «почвенная биота».
Почва является средой обитания большого числа разнообразных микроорганизмов. В 1 г почвы содержится от 1 до 10 млрд клеток микроорганизмов. В почве активно протекают процессы разложения органических природных веществ, при участии широкого разнообразия сапрофитных микроорганизмов.
Для выявления, изучения и учета численности почвенных микроорганизмов используют прямые методы микроскопирования и методы посева из разведений почвенной суспензии на плотные и жидкие среды.
Для прямого микроскопического изучения почвы применяется метод Виноградского в различных модификациях. Суть его заключается в том, что почвенную суспензию, нанесенную на предметное стекло, фиксируют и окрашивают карболовым эритрозином. Окрашенные клетки просчитывают под микроскопом.
Несмотря на то, что методы прямого микроскопирования позволяют выявить и учесть значительно большее количество микроорганизмов (число бактерий, учитываемых прямыми методами, в тысячу раз превышает то, которое учитывается методом посева), метод посева остается одним из распространенных в практике исследования почвенных микроорганизмов. Он позволяет не только учитывать количество, но и групповой (а часто и видовой) состав микрофлоры. Используя этот метод посева, можно из изолированных колоний, выросших на чашках, выделять микроорганизмы в чистые культуры для дальнейшего исследования и идентификации.
Отбор и подготовка почвенного образца дли микробиологического анализа.
При отборе образцов почвы учитывают чрезвычайную макро-, мезо- и микрогетерогенность как микробиологических показателей почвы, так и других ее свойств. С пробной площадки отбирают 3-10 образцов и анализируют их отдельно. Это позволяет получить статистически достоверные результаты о среднем количестве микроорганизмов, а также дает возможность судить о разнообразии и степени разброса полученных данных.
Образцы почв для микробиологических исследований отбирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые пакеты или стеклянную посуду с ватными пробками и др.
При отсутствии возможности анализировать образцы непосредственно после их
сбора в течение нескольких часов высушивают на воздухе, предохраняя от прямых солнечных лучей.
При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо провести следующие операции:
– разрушить почвенные агрегаты;
– десорбировать микроорганизмы с поверхности почвенных частиц;
– выделить из органоминерального геля и дезагрегировать микроколонии микроорганизмов.
Для разрушения почвенных агрегатов чаше всего используют метод растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 мин в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в резиновой перчатке.
Используют также метод обработки почвенной суспензии на электрической мешалке или на ультразвуковой установке.
Перед посевом влажную или сухую почву высыпают на часовое стекло, протертое спиртом, и освобождают от посторонних включений.
Техника посева
1 Навеску подготовленной почвы в 1 г переносят в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды.
2 Готовят разведения почвенной суспензии, для чего 1 мл суспензии из колбы последовательно переносят в ряд пробирок с 10 мл стерильной водопроводной воды.
3 Посев на плотные среды производится из разных разведений. Разведение для высева подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50-200 колоний.
4 Из каждого образца берут не менее трех повторных навесок и каждую высевают не менее чем на трех чашках.
5 На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят каплю почвенной суспензии определенного разведения и с помощью стеклянного шпателя распределяют ее по всему агару.
Засеянные чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат. Сроки учета микроорганизмов зависят от состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов. На МПА обычно, на 2-3 сут инкубации учитывают споровые и неспоровые формы бактерий. На среде Чапека на 5-7-е сут учитывают колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5-7-е сут – колонии грибов и дрожжей.
Подсчет количества колоний на чашке проводят обычно со дна чашки в проходящем свете. На месте подсчитанной колонии чернилами по стеклу или маркером ставится точка.
Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вычисляют их среднее число на одной чашке и затем делают пересчет для определения содержания микроорганизмов в 1 г почвы по формуле:
а = б • в • г,
где
а – количество клеток в 1 г почвы;
б – среднее количество колоний на чашке;
в – разведение, из которого сделан посев; г- количество капель в 1 мл суспензии.
Результаты обрабатывают статистически, рассчитывают ошибку среднего арифметического, среднее квадратичное отклонение и коэффициент вариации.
Вопросы для обсуждения.
1. Какие группы микроорганизмов исследуют в пробах почвы?
2. Какое время необходимо для проведения микробиологического анализа почвы?
3. В каком объеме почвы принято учитывать концентрацию микроорганизмов?
