На предметное стекло наносят бактериологической петлей каплю физиологического раствора или воды, затем осторожно снимают зубной налет спичкой (без серной головки), растирают в капле и тонким слоем распределяют по поверхности стекла. Мазок подсушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают.
Высушивание приготовленного препарата производится на воздухе или в термостате. Подогревать препарат не рекомендуется, так как при быстрой потере влаги происходит грубое свертывание белков, и клетка теряет естественную форму. При высушивании препарат предохраняют от мух, накрывая стеклянным колпаком.
Фиксация высушенного препарата преследует цели: обеспечить лучшее прилипание микробных клеток к стеклу, убить микроорганизмы (мертвые клетки окрашиваются лучше живых).
Фиксация препарата производится над пламенем спиртовки или газовой горелки. Предметное стекло берут за уголки большим и указательным пальцами и медленно проводят, держа стороной с нанесенным препаратом вверх, через пламя не менее трех раз. В общей сложности мазок должен подвергаться действию пламени не более 2 с. Длительная фиксация может изменить структуру микробных клеток и их форму; недостаточно зафиксированный мазок смывается со стекла при последующей обработке. Для фиксации можно использовать различные химические вещества. В абсолютном спирте мазки выдерживают 15-30 мин, в смеси равных объемов спирта и эфира – 2-5 мин., в метиловом и амиловом спирте – 5 мин. Фиксируют препарат, погружая мазок в кювету с одним из указанных веществ или наливая последние на мазок.
Лабораторная работа № 10. Окраска простая и сложная (по Граму)
Цель работы. Освоение методов приготовления и окрашивания бактериальных препаратов.
Задание.
1 Изучить метод простого окрашивания и окрашивания микроорганизмов по Граму.
2 Изучить рост бактерий (их популяций).
3 Определить оценку роста бактерий.
Метод простой окраски. При простом методе окраски используется один какой-нибудь красящий раствор, чаще всего фуксин Пфейффера или метиленовый синий.
Техника окраски. На фиксированный препарат помещают пипеткой несколько капель красящего раствора так, чтобы покрыть всю поверхность мазка.
Фуксином Пфейффера красят 1-2 мин., метиленовым синим раствором – 3-5 мин. Затем краску смывают водой, а мазок просушивают между листочками фильтровальной бумаги или на воздухе.
Сложные методы окраски применяют в целях диагностики, выявления отличительных структур микробов в случаях, когда последние не окрашиваются простым способом. К сложным методам относятся, например, окраска по Граму, окраска спор, капсул и др.
Окраска по Граму. Универсальный дифференциально-диагностический метод окраски.
По отношению к окраске по Граму все виды микробов принято делить на две группы: грамположительные (грампозитивные) и грамотрицательные (грамнегативные).
Метод окраски по Граму основан на использовании способности магниевых солей рибонуклеиновой кислоты, содержащихся в цитоплазме целого ряда микробов (грамположительных), вступать в реакцию с генциан- или кристаллвиолетом и йодом, образовывая стойкое соединение, не разрушающееся при последующем воздействии спирта,
Грамотрицательные микробы, имеющие иной состав цитоплазмы, прочного соединения с генцианвиолетом не образуют и при обработке спиртом обесцвечиваются, а при дополнительной окраске водным раствором фуксина окрашиваются в розово-красный цвет.
Техника окраски по Граму
На обычно приготовленный и фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги (несколько уже и короче предметного стекла) и на нее капают карболовый раствор генцианвиолета или кристаллвиолета на 2 мин. Затем бумагу удаляют, краску сливают, и на препарат наливают люголевский раствор на 2 мин. (мазок чернеет). Сливают люголевский раствор и в течение 30 с обрабатывают 96-градусным спиртом. Промывают водой. Дополнительно 2 мин. окрашивают фуксином Пфейффера. Промывают водой, высушивают и микроскопируют (исследуют под микроскопом).
При этом грамположительные микробы окрашиваются в темно-фиолетовый, почти черный, цвет, а грамотрицательные – в розово-красный.
Шаровидные формы микробов (кокки) в большинстве своем красятся по Граму положительно, извитые формы – отрицательно. Среди палочковидных форм микробов встречаются и грамположительные, и грамотрицательные (палочки, образующие споры, окрашиваются обычно положительно).
