Цель работы. Определение этапов выделения чистых культур.
Задание.
1 Изучить методы пересева микроорганизмов на твердой среде, на жидкой среде, метод разведения Пастера, метод Коха и Драгильского.
2 Изучить метод пересева в чашку Петри.
Изучить как определяются культуральные свойства выросших в чашках колоний.
4 Изучить капельный метод выделения чистой культуры из одной клетки.
Пересев культуры.
Пересев микроорганизмов, выращенных на твердой среде в пробирках, в другие пробирки со средой выполняется в определенной последовательности:
На пробирке со свежей питательной средой разборчиво подписывают название микроорганизма, ставят дату посева. Надписи делают чернилами по стеклу или стеклографом.
Зажигают горелку. Посевы проводят над пламенем горелки, чтобы теплый воздух препятствовал осаждению микроорганизмов из окружающего воздуха и отчасти их уничтожал.
Берут и правую руку бактериологическую петлю, с помощью которой осуществляют посев (петлю держат как карандаш).
Стерилизуют бактериологическую петлю в пламени горелки, прокаливая проволоку докрасна, и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, который будет вводиться в пробирку с культурой микроорганизмов. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была раскалена.
Берут в левую руку две пробирки: одну со стерильной средой (дальше от себя), другую – с культурой микроорганизмов (ближе к себе).
Не выпуская бактериологической петли в правой руке, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружные концы ватных пробок к ладони и вынимают пробки из пробирок. Класть пробки па стол нельзя.
Слегка обжигают в пламени горелки края открытых пробирок.
Вводят в пробирку с культурой микроорганизмов петлю. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности пробирки или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого отбирают небольшое количество микробной массы.
Вынимают петлю и вводят ее в пробирку со стерильной питательной средой, избегая прикосновения со стенками пробирки.
Проводят петлей от дна вверх зигзагообразную или прямую черту-штрих, слегка касаясь поверхности агара.
Обжигают ватные пробки и края пробирок одновременно в пламени и закрывают обе пробирки.
Обжигают петлю в пламени.
Пересев культур микроорганизмов, выращенных в жидкой среде, выполняется с учетом особенностей характеристик среды:
Из стерильной бумаги вынимают градуированную стерильную пипетку за верхний конец. Берут пипетку средним и большим пальцами правой руки, не касаясь поверхности той части пипетки, которая будет вводиться в сосуд с жидкой средой.
Берут в левую руку пробирку (или колбу) с культурой микроорганизмов, выращенной в жидкой среде, и держат ее в вертикальном положении, чтобы не замочить пробку.
Открывают пробку, соблюдая все правила стерильности, описанные выше, и вводят пипетку в пробирку.
Набирают в пипетку суспензию микроорганизмов, закрывают пробкой пробирку (или колбу), вносят определенное количество суспензии в свежую стерильную питательную среду, соблюдая описанные правила предосторожности.
Пипетку помещают в сосуд с дезинфицирующим раствором (0,5-3 %-м водным раствором хлорамина или 3-5 %-м водным раствором фенола), не касаясь ею окружающих предметов.
При использовании этих методов иногда получаются не чистые, а смешанные культуры. Это является результатом того, что колонии могут образоваться не из одной, а из двух или нескольких клеток, попавших в одну точку. Поэтому метод выделения чистых культур требует двух- или трехкратного повторения выделения культур из одной колонии. Для выделения чистых колоний бактерий из смеси бактерий применяют посев на твердую среду штрихом, или посев разведением. Для выделения чистых культур многих бактерий используют МПА, для дрожжей – сусло-агар.
Метод разбавления Пастера (метод предельных разведений).
Заключается в том, что из исследуемого материала делают ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде. Для этого каплю посевного материала вносят в пробирку со стерильной жидкой средой, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так засевают до 8…10 пробирок. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться и можно получить такое разведение, в котором во всей пробирке со средой будет находиться только одна микробная клетка, из которой разовьется чистая культура микроорганизма. Так как в жидких средах микробы растут диффузно, т.е. легко распределяются во всей среде, то изолировать одну микробную клетку от другой трудно. Таким образом, метод Пастера не всегда обеспечивает получение чистой культуры. Поэтому в настоящее время этот метод используется, главным образом, для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед посевом его в плотную среду для получения изолированных колоний.
