О возможной гипогликемизирующей активности препаратов можно судить по их влиянию на содержание глюкозы в крови интактных животных. В связи с этим тестирование исследуемых веществ на животных с экспериментальным диабетом не представляется необходимым на первом этапе скриннинга.
Для опыта используют кроликов весом 2-2,5 кг, которым не дают пищу в течение суток. Вещества вводят внутрь через зонд или (при необходимости) другим способом. Каждый час берут пробы крови из вены уха (8 проб). Каждую дозу исследуемого препарата изучают на 3 кроликах, в качестве стандарта используют бутамид.
Гипогликемический эффект оценивается по самому низкому уровню сахара из 8 проб и выражается в процентах активности бутамида. Каждое вещество обычно испытывают в дозах 500 и 1000 мг/кг (при скриннинге сульфаниламидных препаратов).
При отборе веществ, близких хлорпропамиду, по строению используют крыс самцов линии Wistar, весящих 150-175 г (Holland е. а., 1961). Животных не кормят в течение 18 ч до введения исследуемых веществ. Препараты назначают через зонд в дозах 10 мг/кг в 1 % растворе карбоксиметилцеллюлозы. Концентрацию глюкозы в образцах крови определяют методом Hoffman (1937) с использованием автоанализатора. Пробы крови берут перед введением препарата и затем через 2 и 4 ч после введения. Для тестирования веществ используют по 6 крыс в каждой группе. При уменьшении концентрации глюкозы в крови на 5-10, 10-20, 20-30 и на 30-40% активность веществ оценивается соответственно + 1, +2, +3, +4. Активность хлорпропамида через 2 и 4 ч после введения составляет +4 и +4, бутамида соответственно +2 и +1.
Половые гормональные препараты и анаболические средства
Методы изучения активности половых гормонов разработаны весьма детально. Этот вопрос хорошо освещен в ряде пособий и обзорных статей (Я. М. Кабак, 1945, 1964, и Др.). Ниже приведены основные простые и наиболее употребительные приемы выявления биологической активности половых гормональных препаратов.
Эстрогенные препараты. Исследование функции яичников базируется на анализе изменений микроскопической картины содержимого влагалища, связанных с циклической функцией яичников.
В стадии покоя в мазке из влагалища мыши или крыс обнаруживаются лейкоциты и обильное количество слизи, в стадии предтечки, продолжающейся 10 - 22ч, в мазках определяются лишь эпителиальные клетки с ядрами овальной формы, в стадии течки, продолжающейся сутки или немного больше, обнаруживаются лишь безъядерные ороговевшие эпителиальные клетки, в стадии после течки, продолжительность которой не превышает 5-6 ч, среди ороговевших клеток появляются лейкоциты и иногда эпителиальные клетки.
Для наблюдения используют половозрелых мышей или крыс. Влагалищные мазки берут платиновой петлей или ватным тампоном. Возможно использование глазной пипетки для промывания влагалища 1-2 каплями дистиллированной воды. Одну каплю этой жидкости затем используют для анализа. Содержимое тампона смывают на предметное стекло одной каплей дистиллированной воды и готовят мазки. Исследуемые препараты вводят подкожно. Эффект сравнивают с действием стандартных эстрогенов. Для тестирования эстрогенов могут быть изучены изменения веса матки у мышей (Rubin е. а., 1951).
Гестагены
Пролиферацию эндометрия используют как тест для оценки активности гестагенных гормонов. Наблюдения проводят на неполовозрелых кроликах весом 800-1000 г. Животных содержат в индивидуальных клетках и подкожно вводят эстрадиол в общей дозе 3-5 мкг в течение 6 дней. Затем им подкожно вводят различные дозы исследуемого вещества и прогестерона (0,8 мг в течение 5 дней). Сопоставляют пролиферативное действие исследуемого препарата с контрольными животными, получавшими эстроген, и с эффектом прогестерона. Каждая серия наблюдений состоит, как минимум, из гистологических исследований маток 3 кроликов. Другие тесты, основанные на учете прочих морфологических сдвигов в миометрии и влиянии на течение беременности, используют более редко (Elton, 1962, и др.).
Андрогены вызывают изменения в половой сфере и анаболический эффект, проявляющийся в увеличении веса семенных пузырьков и повышении поглощения азота. Для оценки миотропного и анаболического эффектов учитывают прирост веса m. levator ani, андрогенный эффект препарата оценивают по изменениям веса предстательной железы. Используют кастрированных крыс самцов трехнедельного возраста, содержащихся на одинаковой диете, по 5 животных в группе. Каждому животному, начиная со дня кастрации, в течение 7 дней вводят подкожно раствор исследуемого вещества в масле. На 8-й день, через сутки после заключительной инъекции, животных забивают, отпрепаровывают m. levator ani и предстательную железу и взвешивают их с точностью до 0,1 мг. Соотношение прироста веса m. levator ani к приросту веса предстательной железы используют для оценки соотношения анаболического и андрогенного эффектов. Эффект исследуемого вещества сравнивают с действием тестостерона пропионата. Описанная методика может быть использована для тестирования антиандрогенной активности препаратов. Для оценки анаболического действия препаратов, помимо учета миотропного действия, определенный интерес представляет изучение потребления пищи и изменения общего веса подопытных животных.
Глюкокортикостероиды
Активность соединений этой группы может быть обнаружена при различных методах в связи с разнообразной картиной действия глюкокортикоидов. В частности, эффект стимуляции инволюции вилочковой железы наиболее широко используют при скриннинге и биологической валоризации препаратов типа кортикотропина (АКТГ.).
Влияние на инволюцию вилочковой железы изучают в опытах на крысах весом 35-40 г (возраст 21-23 дня). Каждая группа крыс (5 или 10 животных) должна иметь одинаковый суммарный вес, так как оценка результатов эксперимента в значительной мере зависит от среднего веса животных в группе. На время экспериментов крыс помещают в изолированной комнате с постоянной температурой воздуха. Исследуемый раствор вводят подкожно в 9 и 17 ч, в течение 3 дней. Интервал логарифма доз обычно составляет 0,301. На 4-й день крыс забивают хлороформом. Определяют вес тела и тщательно отпрепарованной вилочковой железы. В качестве стандарта может быть использован кортизон ацетат в дозе 200 мкг (3-дневная доза), вызывающий уменьшение веса железы с 400 мг/100 г (контроль) до 200 мг/100 г (Stephenson, 1954).
Метод Ринглера и Браунфилда (1960) предусматривает использование незрелых крыс самок весом 40-60 г, которым назначают подкожно стероиды, взвешенные в 0,2 мл раствора карбоксиметилцеллюлозы. Контрольные животные получают растворитель. Спустя 48 ч животных вскрывают, регистрируют вес тела и вилочковой железы. Результаты выражают в мг/100 г веса. В контроле вес вилочковой железы составляет 360 мг/100 г. Для статистической обработки результатов используют 12 или более животных на каждую дозу исследуемого вещества.
Определение гликогена в печени также довольно широко используют при отборе веществ с глюкокортикоидной активностью в связи с тем, что последние существенно увеличивают содержание гликогена в печени. Белые мыши самцы в течение 2 дней получают диету, содержащую 26% белка и 52% углеводов, а также воду, содержащую 0,9% хлорида натрия и 5% глюкозы. После наркотизирования нембуталом проводят адреналэктомию. Со второго послеоперационного дня глюкозу исключают из диеты. На третий день мыши не получают пищи, а со следующего утра и воды. Через каждые 45 минут, начиная с 9 ч 15 мин и до 14 ч 30 мин животным внутривенно вводят 0,20 мл 5% раствора глюкозы, 10% алкоголя (контроль) и исследуемое вещество. Таким образом, в целом вводят 70 мг глюкозы в 1,4 мл раствора. В 15 ч 30 мин мышей взвешивают, наркотизируют 0,2 мл 1,8% раствора барбамила и проводят экстирпацию печени. Затем печень помещают в 4 мл теплого раствора 30% гидрата окиси натрия, находящегося в центрифужной пробирке. Пробирку подогревают и встряхивают до растворения ткани. Гликоген осаждают добавлением 1,2 объёма 95% алкоголя. Пробирки подогревают до кипения, затем охлаждают на льду и центрифугируют. Содержимое выливают, стенки пробирки отмывают 0,5 мл алкоголя, который возгоняется при подогревании в водяной бане. Гликоген гидролизуют, глюкозу определяют по методу Сомоджи (Good е. а., 1933). Содержание гликогена выражается в миллиграммах глюкозы на 100 г веса тела. Эффект исследуемого вещества (в процентах содержания гликогена) сопоставляют с аналогичными данными контрольных опытов.
Эозинопения у адреналэктомированных мышей является характерной реакцией на введение глюкокортикоидов. Опыты проводят на мышах самцах весом 20-25 г (линии Jax C57 Brown, cd). Животные находятся в помещении при температуре 28°, питьевая вода содержит 1% натрия хлорида. Во время операции имплантируется 15 мг дезоксикортикостерона. Через 3 дня после операции мыши получают 5 мкг адреналина подкожно и 4 ч спустя 1-6 мкг гидрокортизона в 0,03 мл масла. Кровь берут из хвоста до инъекции и через 3 ч после введения вещества. Мышей с числом эозинофилов менее 100 в 1 мм3 из опыта исключают. Если принять активность гидрокортизона за 1, активность преднизолона, триамсинолона и дексаметазона по этому тесту выражается соответственно коэффициентами 3,3, 3,2 и 10 (Tolksdorf, 1959).
Влияние на воспалительный отек. Опыты проводят на взрослых мышах обоего пола весом 25-35 г. Отек лапы вызывают введением 0,05 мл 3,5% формалина в 0,9% растворе натрия хлорида. Исследуемое вещество вводят в лапу мыши дважды: за 24 ч и за 30 мин до введения агента, вызывающего воспаление. Растворы вводят в объеме 0,1 мл, при рН 7,0. Каждой мыши внутривенно вводят 0,1 мл 0,5% раствора красителя Эванса синего и 0,1 мл раствора формалина в 0,9% растворе натрия хлорида подкожно в дорсальную поверхность правой задней лапы. Левая задняя лапа получает такой же объем солевого раствора и служит контролем. Спустя 1 час, два наблюдателя измеряют кумуляцию синего красителя и опухоль в подопытной и контрольной лапах. Шкала оценки: 0 — отсутствие различий по сравнению с контролем, 1 — незначительная разница, 2 — заметное различие и 3 — резкое различие с контролем.
Вместо формалина могут быть использованы 5-окситриптамин (5 мкг/мл.), гистамин (1 мг/мл), декстран (60 мкг/мл), свежий яичный желток (0,5% раствор), горчица, каолин и некоторые другие раздражающие вещества, вызывающие отек задней конечности крысы (Ж. И.Абрамова, 1954).
Кроме мышей в опыте могут быть использованы крысы, кролики и другие животные. В опытах на крысах каждому животному внутривенно вводят 2 мг красителя Эванса синего и исследуемое вещество за 30 мин до введения агента, вызывающего воспаление. Интенсивность окраски отмечается в соответствии с приведенной выше шкалой. Объем лапы может быть измерен плетизмографически при наркотизировании.крыс этаминалом-натрия (40 мг/кг).
Торможение воспалительной реакции в ответ на введение инородного тела. Белым крысам самкам весом 100-120 г имплантируют подкожно шарик (весом 30±1 мг) в область спины (Реrrinе е. а., 1959). Дважды в день, начиная со 2-го часа после операции, крысам (по 6 животных в группе), вводят подкожно суспензию исследуемых стероидов (0,1 мл). Контрольная группа крыс получает растворитель, содержащий 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 0,4% твина на 0,9% растворе натрия хлорида. Препарат вводят 5 дней, на 6-й день всех животных забивают. Шарики с окружающей их тканевой гранулемой вырезают и взвешивают. Строят график, отражающий зависимость эффекта (процент снижения веса гранулемы) от логарифма дозы. Сравнивают эффект на уровне доз, вызывающих редукцию гранулемы до общего веса 600 или 1000 мг. По этому тесту триамсинолон в 5 раз более активен, чем ацетат гидрокортизона.
Торможение активности гиалуронидазы. Оценивают степень торможения влияния гиалуронидазы на адсорбцию веществ, вводимых подкожно. Опыты проводят на мышах самках весом 20-22 г (по 5 животных в группе). Водный раствор уретана в дозе 1,2 мг/г веса вводят подкожно. Время с момента введения уретана до потери рефлексов положения определяют как время адсорбции препарата. Раствор гиалуронидазы, содержащий 380 ЕД/мл, вводят в вену хвоста в дозе 0,01 мл/г, исследуемое вещество — подкожно или внутрь перед инъекцией гиалуронидазы. Определяют минимальную дозу, необходимую для полного торможения эффекта гиалуронидазы по времени адсорбции (Fabinyi-Szebehe1у, 1953).
Влияние на осмотическую резистентность эритроцитов может быть изучено при воздействии исследуемых веществ in vivo и in vitro.
Из дважды перекристаллизованного и высушенного до постоянного веса натрия хлорида готовят растворы нисходящей концентрации от 0,90 до 0,30% с разницей между ними 0,01-0,02%. Для большинства исследований можно ограничиться применением растворов в концентрациях от 0,56 до 0,32%. Растворы вносят в количестве 0,5 мл в пронумерованные, тщательно вымытые и высушенные центрифужные пробирки. В каждую пробирку добавляют по 0,05 мл исследуемой крови. После 60-минутной экспозиции при 37°С кровь центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Результаты оценивают визуально. Минимальная устойчивость эритроцитов выражается концентрацией натрия хлорида, в которой появилось бледно-желтое окрашивание, максимальная — концентрацией, соответствующей полному гемолизу. Для получения более точных результатов проводят фотометрическое исследование проб при толщине слоя 1 мм, используя синий светофильтр. Экстинкция окраски, обусловленной гемолизом 0,05 мл крови в 0,5 мл дистиллированной воды, соответствует разрушению 100% эритроцитов исследуемой пробы. Полученные результаты обрабатывают статистически с определением достоверности различий.
Флуоресцеиновый тест для изучения проницаемости оболочки эритроцитов. Методика основана на количественном определении содержания флуоресцеина в эритроцитах после воздействия лекарственными препаратами как in vivo, так и in vitro.
Определение флуоресцеина проводили на флуорометре типа ЭФ-ЗМА. С целью повышения чувствительности метода в качестве регистрирующего устройства может быть использован фотокомпенсационный микровольтамперметр типа Ф 116/2. В 5 мл 0,002% раствора флуоресцеина (на изотоническом растворе натрия хлорида) прибавляли 0,05 мл крови и инкубировали при 37°С в течение часа. После центрифугирования в течение 7 мин при 4000 об/мин эритроциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, гемолизировали 10 мл дистиллированной воды и проводили флуорометрическое исследование.
В связи с тем, что гемоглобин поглощает флуоресцеин, наличие последнего целесообразнее определять после осаждения его трихлоруксусной кислотой. С этой целью в пробирку с гемолизированными эритроцитами добавляли 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и центрифугировали в течение 7 мин при 4000 об/мин. Затем к 1,5 мл надосадочной жидкости добавляли 8,5 мл дистиллированной воды и определяли содержание флуоресцеина.
Влияние на кислотную резистентность эритроцитов. Определение изменения резистентности эритроцитов производится с помощью установки, состоящей из фотоэлектроколориметра, водяного ультратермостата и термостатированной кюветы (И. И. Гительзон, И. А. Тесков, 1959). В качестве гемолитика используется 0,004 соляная кислота на 0,85% растворе натрия хлорида. Исследование проводят при температуре проточной жидкости в термостатированной кювете 24±0,1°С.
Кровь для исследования разводят изотоническим раствором натрия хлорида. В таком виде она пригодна для исследования в течение 3-4 ч при хранении в условиях комнатной температуры. Затем в кювету, содержащую изотонический раствор натрия хлорида, медленно прибавляют взвесь исследуемых эритроцитов до достижения оптической плотности 0,700 на шкале левого барабана ФЭК (при этом стрелка гальванометра с уровня 0,700 возвращается к 0). Отбирают 2 мл стандартной взвеси, прибавляют к ней 2 мл 0,004 N соляной кислоты и каждые 30 с регистрируют уменьшение оптической плотности, что связано с гемолизом эритроцитов.
Влияние исследуемых веществ на кислотную резистентность эритроцитов можно изучать в различные сроки после их введения подопытным животным или при воздействии на эритроциты in vitro.
Влияние на проницаемость гисто-гематических барьеров. В основу методики положено определение количества сульфацила натрия, проникающего в ткань изучаемого органа, и соотнесение его к концентрации препарата в крови. С этой целью крысам внутривенно вводят 20% раствор сульфацила натрия из расчета 200 мг/кг. Через 30 мин животных забивают и извлекают ткани исследуемых органов и кровь (0,2 мл). Навески тканей (0,75-1,0 г) тщательно отмывают от крови и растирают со стеклянным песком. После осаждения белков в фильтрате определяют концентрацию сульфацила натрия реакцией диазотирования с Н-кислотой.
Коэффициент проницаемости представляет выраженное в процентах отношение содержания сульфацила натрия в тканях к его концентрации в крови.
В заключение следует отметить, что при первичном фармакологическом исследовании глюкокортикоидов и противовоспалительных средств заслуживает внимания изучение их действия на проницаемость капилляров (И. А. Ойвин и др., 1962; Я. И. Хаджай и др., 1972) и бимолекулярных липоидных мембран (А. А. Россельс и др., 1971).
Интересной представляется также оценка противовоспалительной активности исследуемых веществ при экспериментальном артрите (Newbould, 1963), асците (Teotino е. а,, 1963), плеврите (Weisbach е. а., 1963), ультрафиолетовой эритеме (Adams, 1960), и некоторых других моделях воспалительного процесса.
Антихолестериновые препараты
Методы изучения активности антихолестериновых средств основаны главным образом на анализе содержания холестерина в сыворотке животных с экспериментальной гиперхолестеринемией и на данных патогисто-логического исследования. Большую ценность могут представлять также тесты с изучением влияния исследуемых веществ на адсорбцию, образование и выделение холестерина (Steinberg, 1962; К. А. Мещерская и др., 1966).
Экспериментальный атеросклероз у кроликов (Н. Н. Аничков, 1956). Опыты проводят на взрослых (желательно старых) кроликах. Холестерин вводят ежедневно через зонд в желудок в дозах 0,2- 0,5 г/кг в масляном растворе в течение 2-3 месяцев. Определяют содержание холестерина в крови до начала и в конце опыта (обычно через два месяца кормления содержание холестерина в крови достигает в среднем 1000 мг% при 60-150 мг% в контроле). К этому времени в аорте наблюдается появление атероматозных бляшек, локализующихся преимущественно в верхних ее отделах. Динамика гиперхолестеринемии и степень морфологических изменений в стенке аорты в сравнении с контролем служат основными критериями оценки влияния исследуемых веществ на экспериментальный атеросклероз.
Влияние на гиперхолестеринемию. Крысы самцы линии Sprague — Dawley весом 270-290 г получают диету, содержащую 2% холестерина, 1% холевой кислоты, 20% гидрогенизированного жира, 49% углеводов, 4% алфацела, 4% витаминов и минеральных солей и 20% белков. В течение 7 дней животным ежедневно вводят подкожно исследуемое вещество. На 7-й день крысы не получают пищи в течение 16 часов. На 8-е сутки животных декапитируют, кровь исследуют на содержание холестерина. Результаты сопоставляют с данными контрольной группы опытов. При воспроизведении алиментарной холестеринемии хорошие результаты дает дополнительное введение антитиреоидных препаратов типа метилтиоурацила.
Более простым методом скриннинга антихолестериновых средств является исследование концентрации холестерина после девяти ежедневных инъекций исследуемого вещества в кукурузном масле. Кровь для анализа берут из аорты через 24 часа после введения последней дозы. В опыте используют взрослых крыс самцов весом 200-250 г. Концентрация холестерина в сыворотке крови определяется по методу Zlatkis с соавторами (1953).
Удобным объектом исследования антихолестеринового действия служат цыплята и взрослые куры с экзогенной (нагрузка холестерином) и эндогенной (диета с дефицитом белка) гиперхолестеринемией (Griminger, Fisher, 1958).
Около 30-90% вводимого холестерина переходит в желчные кислоты, в связи с чем исследование их экскреции может быть использовано для оценки возможного антихолестеринового действия испытуемых препаратов. Особенно перспективным в этом плане представляется использование С14-холестерина с последующим определением его содержания в сыворотке и экскретах (Kritchevsky, 1964).
Антацидные средства
Действие антацидных средств обусловлено или нейтрализацией соляной кислоты желудочного сока, или торможением ее продукции. В первом случае большую роль играют наблюдения in vitro; для обнаружения угнетающего влияния на секреторную активность желудка проводят тестирование в острых опытах на крысах.
Влияние на секрецию желудка у крыс. В опыт берут крыс самцов весом 150-200 г, содержащихся в индивидуальных клетках. Перед опытом животных лишают пищи на 24 часа. Под пентобарбиталовым наркозом вскрывают брюшную полость и перевязывают привратник. После 30-минутного интервала в полость желудка вводят исследуемое вещество; через два часа изучают динамику кислотности желудочного сока. Пробы для анализа берут из полости желудка путем его прокола иглой. Полученные результаты сопоставляют с аналогичными данными контрольных опытов (Friedman е. а., 1946).
При использовании методики наложения хронической фистулы желудка у крыс (Н. Н. Лебедев и др., 1963) возможна оценка кислотности содержимого желудка в повторных сериях наблюдений.
Влияние на кислотность желудочного сока оценивают по измерению рН жидкости, используемой для непрерывной перфузии желудка.
Крыс наркотизируют уретаном. В нижний отдел пищевода вводят полиэтиленовую трубку длиной 10-15 см с внутренним диаметром 2 мм. Вскрывают брюшную полость и в желудок через разрез в двенадцатиперстной кишке вводят стеклянную канюлю. Важно при фиксации канюли в привратнике не повредить основные сосуды, проходящие в этой области. Желудок вскрывают, делая разрез длиной 2,5-3 см, содержимое его удаляют ватным тампоном, полость желудка промывают. Затем желудок зашивают непрерывным швом через все оболочки. Закрывают брюшную полость. Желудок непрерывно перфузируют теплым раствором 0,00025 NaOH (1 мл/мин). Постоянно регистрируют рН раствора, оттекающего через дуоденальную канюлю (в норме рН перфузата колеблется в пределах 6,0-6,5). Исследуемые вещества вводят в яремную вену в объеме 0,1-0,4 мл раствора вслед за 0,1 мл солевого раствора. Для сравнения вводят однозамещенный фосфат гистамина, который на 14-й минуте вызывает падение рН перфузата с 6,0 до 4,0. Для этого же можно назначать карбохолин.
Для оценки тормрзящего действия на желудочную секрецию исследуемые вещества можно вводить вместе с гистамином или в определенные интервалы до инъекции гистамина.
В связи с длительностью опыта необходимо обеспечить согревание животного под контролем ректальной термометрии (Ghosh е. а., 1958).
Определенный интерес для отбора антацидных средств может представлять изучение их спазмолитической активности на изолированном сегменте тонкого кишечника в силу сопряженности спазмолитического и гипацидотического эффектов (Linder е. а., 1963).
В качестве заключительного этапа фармакологического скриннинга средств, тормозящих секрецию желудка, большую ценность могут представлять наблюдения на собаках с фистулой желудка или изолированным желудочком по методу И. П. Павлова.
