Перспективы генной инженерии в животноводстве

Основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках ядра, отгороженного ядерной мембраной от цитоплазмы. Отсутствие ядра является лишь внешним проявлением особой организации генома у прокариот.

Геном прокариот построен очень компактно. Количество некодирующих последовательностей нуклеотидов минимально. Многие механизмы регуляции экспрессии генов, использующиеся у эукариот, никогда не встречаются у прокариот. Простота строения генома прокариот объясняется их упрощенным жизненным циклом.

Ген — единица наследственной информации, занимающая определенное положение в геноме или хромосоме и контролирующая выполнение определенной функции в организме. По результатам исследования прокариот, главным образом Е. сoll, ген состоит из двух основных элементов: регуляторной части и собственно кодирующей части. Регуляторная часть гена обеспечивает первые этапы реализации генетической информации, заключенной в структурной части гена; структурная часть гена содержит информацию о структуре кодируемого данным геном полипептида. Количество некодирующих последовательностей в структурной части гена у прокариот минимально. 5'-конец прокариотического гена имеет характерную организацию регуляторных элементов, особенно на расстоянии 50 — 70 н.п. от точки инициации транскрипции. Этот участок гена называют промотором. Он важен для транскрипции гена, но сам в РНК не транскрибируется. Противоположный 3'-конец — терминаторная область, необходимая для тер-минации транскрипции. В РНК он также не транскрибируется. Транскрипция начинается со стартовой точки (+1).

Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, находятся на 3'-конце гена и называются транскрипционными терминаторами. Они содержат последовательности, которые в транскрибируемой РНК формируют структуру шпильки.

Кроме хромосомы у большинства бактерий существуют другие способные к автономной репликации структуры — плазмиды. Это двуцепочечные кольцевые ДНК размером от 0,1 до 5% размера хромосомы, несущие гены, необязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде. Именно такие внехромосомные элементы и содержат гены, которые придают клеткам наследуемую устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Они получили название факторов резистентности, или К-факторов. Другие плазмиды определяют болезнетворность патогенных бактерий, например патогенных штаммов Е. соli, возбудителей чумы и столбняка. Третьи — определяют способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, например углеводороды нефти.

У прокариот (рис. 82) основным типом организации генов являются опероны (например, лактозный оперон кишечной палочки Е. coli).

Оперон Е. coli — это группа структурных генов А, В, С, расположенных друг за другом, которые имеют общий промотор, оператор (нуклеотидные последовательности промотора и оператора перекрываются) и терминатор. Они участвуют в одном метаболическом цикле (в данном случае расщепление лактозы до глюкозы и галактозы) и регулируются координированно. Структурные гены в составе оперона находятся под контролем оператора. Регуляция оперона осуществляется геном-регулятором (см. рис. 84).

33. Молекулярная организация генов и геномов эукариот.

Главная количественная особенность генетического материала эукариот - наличие избыточной ДНК. Геном – количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хромосом данного вида.

Высокоповт. послед-ти – сателитные ДНК – короткие тандемные повторы длинной 1-2 н.п, организованы в протяженные блоки. Содержание сат-ДНК 5-50% от суммарной ДНК. Свойства сателлитов: 1) быстрая и точная реасоциация в процессе ренатурации ДНК. 2) простоя первичная структура – базовая последовательность 5-7 нуклеотидов. 3) множество копий, нахождение в составе хромосом в виде тандемно расположенных протяжных кластеров. 4) пурин-перимединовая симметрия в распределении нуклеотидов по цепи ДНК. 5) концентрирование в процентромерном гетерохроматине.

Умер. повт. посл-ти. 1)гены домашнего хозяйства – гены гистоны, тРНК и рРНК. Построены из идентичных копий, тандемно повторяются. Сгруппированы в одной или нескольких районах для комбинированного синтеза. 2)гены, кодирующие гомологичные белки со сходными функциями: актины, табулины, глобулины, иммуноглобулины, гены теплового шока. Собраны в кластеры, специализированы. 3)подвижные генетические элементы (МГЭ) рассеяны по геному.

Выделяют два основных класса подвижных ген эукариот:

Транспозоны —участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома. Транспозоны также известны под названием «прыгающие гены» и являются примерами мобильных генетических элементов. Транспозоны формально относятся к так называемой некодирующей части генома — той, которая в последовательности пар оснований ДНК не несёт информацию об аминокислотных последовательностях белков, хотя некоторые классы мобильных элементов содержат в своей последовательности информацию о ферментах, транскрибируются и катализируют передвижения. У разных видов транспозоны распространены в разной степени: так, у человека транспозоны составляют до 45 % всей последовательности ДНК, у плодовой мухи Drosophila melanogaster часть мобильных элементов составляет лишь 15-20 % всего генома.

Ретротранспозоны —мобильные генетические элементы, которые применяют метод «копировать и вставить» для распространения в геноме животных. По крайней мере 45 % генома человека составляют ретротранспозоны и их производные. Процесс передвижения включает промежуточную стадию молекулы РНК, которая считывается с участка ретротранспозона и которая затем, в свою очередь, используется как матрица для обратной транскрипции в последовательность ДНК. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома.

Избыточность генома эукариот объясняется также экзон-интронной организацией большинства эукариотических генов, при которой значительная часть транскрибированной РНК удаляется в ходе следующего за синтезом процессинга и не используется для кодирования аминокислотных последовательностей белков.

Большую часть генома эукариот составляют подвижные генетические элементы, которые способны перемещаться в пределах хромосомы.

В эукариотических клетках внехромосомная ДНК представлена генетическим аппаратом органелл - митохондрий и пластид, а также нукл. послед-тями, не являющимися жизненно необходимыми для клетки (вирусоподобными частицами). Наследственный материал органелл находится в их матриксе в виде нескольких копий кольцевых молекул ДНК, не связанных с гистонами. Внехромосомная ДНК составляет менее 1% всей клеточной ДНК.

Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15-98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть уникальных последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина: не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК. Примером таких уникальных последовательностей являются интроны, общий размер которых, как правило, на порядок и более превышает суммарный размер экзонов содержащих их генов.

В общих чертах строение гена про- и эукариот в принципе одинаково. Ген эукариот так же как и у прокариот функционирует только совместно с регуляторными зонами. Но такой тандем у эукариот не называется опероном. Ген эукариот представляет собой в основном кодирующую часть ДНК, а регуляторные зоны – не кодирующую ДНК. Также как и у прокариот, рассмотрим не только строение самого гена – кодирующей его части, но и обслуживающие его элементы – регуляторные зоны.

1. Ген (кодирующая часть) состоит из: экзонов, интронов,

регуляторные участки гена содержат: стартовый кодон – сайт (место) начала транскрипции, терминатор – сайт окончания транскрипции, лидерную последовательность, трейлерную последовательность, промотор, контролирующие зоны располагаются вблизи от обслуживаемого гена, модуляторы (энхансеры, сайленсеры) – располагаются вдали от гена.

Некоторые исследователи объединяют контролирующую зону и модуляторы в одну область – регуляторную область.

Кодирующая часть гена эукариот имеет несколько существенных отличий от аналогичной области прокариот. Отметим два из них.

1. Как правило, кодирующая область представлена не несколькими генами, а одним. Каждый ген у эукариот имеет свою регуляторную область.

2. Если в генах прокариот не кодирующие участки практически отсутствуют, то ген эукариот имеет мозаичное строение – в нём чередуются участки, несущие информацию о последовательности аминокислот в белке и не несущие её. Участки, несущие информацию носят название экзоны, не несущие называются интроны. Число интронов у различных организмов различно.

Мозаичное строение чаше всего встречается в генах, кодирующих белки (с этих генов транскрибируется иРНК) и тРНК. Интересно, что сходные гены у разных организмов одного вида часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях. Обычно длина интронов превышает длину экзонов.

Кодирующая часть гена представляет единицу транскрипции.

Что касается регуляции, то необходимо пояснить, что существуют два термина – регуляторные области (зоны, участки и т.д.) и регуляторные гены (гены-регуляторы).

Регуляторные области – это участки ДНК на которых осаждаются белки-регуляторы. Их функция – регуляция транскрипции. Для простоты эти зоны подразделяют на два типа. Мы их отметили выше, но всё же повторим.

а. Зоны располагающиеся близко от гена, который они контролируют - контролирующие зоны.

б. Зоны располагающиеся далеко от контролируемого гена - модуляторы.

Гены-регуляторы – это обычные структурные гены, кодирующие иРНК несущую информацию о строении какого-либо белка-регулятора. Некоторые из этих генов транскрибируют специальные регуляторные РНК.

Рассмотрим строение регуляторных областей. Их несколько. На 5’- конце гена располагается сайт начала транскрипции. На 3’- конце располагается сайт окончания транскрипции (терминатор). Перед сайтом начала транскрипции, также как и у прокариот, располагается лидерная последовательность, а перед сайтом окончания транскрипции находится трейлерная последовательность. Функциональное значение этих участков аналогично таким же участкам у прокариот. Если у прокариот транскрипцию всех генов осуществляла один фермент РНК- полимераза, то у эукариот существуют три типа РНК-полимераз, которые обеспечивают транскрипцию разных эукариотических генов (генов транскрибирующих иРНК, тРНК и рРНК). У большинства генов эукариот, как и у прокариот, эти ферменты связываются с участком.

Трейлерная последовательность

Лидерная последовательность

Сайт конца транскрипции

Сайт начала транскрипции, расположенный на 5’- конце ДНК перед сайтом инициации. Этот участок носит название промотор. Однако, в отличии от прокариот одна РНК-полимераза соединиться с промотором не способна. Прежде чем связаться с промотором РНК-полимераза эукариот соединяется с многочисленными белками (их около 50), которые способствуют её прикреплению к промотору. Эти белки называются факторами транскрипции, а образовавшийся комплекс РНК-полимеразы с факторами транскрипции именуется комплекс транскрипции (или транскрипционный комплекс). Факторы транскрипции (их так же можно назвать регуляторными белками) активируют РНК-полимеразу и кодируются регуляторными генами.

Образование комплекса транскрипции и его активность в свою очередь контролируют ещё два типа белков-регуляторов. Первый тип белков осаждается на регуляторные (зоны) последовательности ДНК, которые располагаются, как правило, рядом с промотором. Эти белки ускоряют или тормозят образование транскрипционного комплекса. Регуляторные последовательности имеют различные названия. Чаще всего их объединяют термином – контролирующие зоны или цис-регуляторные элементы. К этой зоне относится лидерная последовательность, промотор и регуляторные зоны. располагающиеся рядом с промотором - рядом расположенные области. К контролирующим зонам присоединяются различные регуляторные белки, которые влияют на начальное связывание РНК-полимеразы с промотором. Эти белки носят специальное название – факторы транскрипции.

Второй тип регуляторных последовательностей усиливает или тормозит движение транскрипционного комплекса по гену. У эукариот эти участки часто расположены далеко от контролируемого ими гена: - впереди от 5’- конца кодирующей области, но за несколько тысяч пар нуклеотидов от кодирующего участка, в самой кодирующей области или позади неё. В некоторых случаях их выявляют на других хромосомах.

34. Организмы адаптируются к меняющимся условиям окр среды путём изменения экспрессии (скорости транскрипции) генов. Этот процесс включает взаимодействие спец-х белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. При этом может происходить включение или выключение транскрипции. Эукариотические клетки используют тот же самый принцип, хотя в регуляции реализуются и некоторые другие более сложные механизмы.

Контроль экспрессии генов осуществляется на следующих уровнях:

· на уровне транскрипции (контролируется время и характер транскрипции гена)

· на уровне процессинга первичного транскрипта

· при отборе зрелых мРНК для их транспорта в цитоплазму

· на уровне трансляции - отбор в цитоплазме мРНК для трансляции на рибосомах

· на уровне деградации - избирательная дестабилизация определенных типов мРНК в цитоплазме

· на уровне активности белка - селективная активация, инактивация или компартментация молекул белка после их синтеза.

Экспрессия генов как у прокариот, так и у эукариот регулируется при помощи целого ряда ме­ханизмов.

Концепция оперона в регуляции экспрессии генов у прокариот. Ген обычно неактивен, но когда необходим определенный белок, конкретный ген «активируется», что обусловливает производство этого белка. Таким образом, клетки имеют механизм, контролирующий количество любого белка в определенное время. Синтез белков регулируется генетическим аппаратом, а также факторами внутренней и внешней среды.

Во всех клетках экспрессия генов контролируется регуляторными белками, кот связываются с определенным участком ДНК и т.о стимулируют пли подавляют транскрипцию гена. Действие регуляторных белков обратимо и, как правило, требует присутствия лиганда. Как для белков, так и для участков ДНК, с кот они связ-ся, исп-ся различные наименования в зависимости от принципа действия. Регуляторный белок, который влияет на транскрипцию генов, называют фактором транскрипции. Белок, подавляющий транскрипцию, называют репрессором, а стимулирующий — индуктором. Послед-ти ДНК, с кот связ-ся регуляторные белки, наз-ся регуляторными элементами. У прокариот регул-е элементы, кот служат участками связывания РНК-полимеразы, наз-ют промоторами, в то время как для репрессорных участков связывания употребляется название оператор. Регуляторные элементы, связывающие активирующие факторы, называют энхансерами (усилитель), в то время как элементы, связывающие негативные (ингибирующие) факторы, — сайленсерами (успокоитель).

Многочисленные известные регуляторные белки можно разделить по механизму действия на четыре группы. Негативная ген-я регуляция, т. е. выключение соответствующих генов, может вызываться репрессорами. Некоторые репрессоры связываются с ДНК только в отсутствие спец-го лиганда. Комплекс репрессора с лигандом в этом случае теряет способность к связыванию и оставляет свободным участок промотора для присоединения РНК-полимеразы. Часто свободный от лиганда репрессор не может связываться с ДНК, т. е. транскрипция подавляется только в присутствии лигандов. Аналогично при позитивной ген-й регуляции можно различать 2 случая. Если связывается только свободный индуктор, транскрипция подавляется соответствующими лигандами. Напротив, многие индукторы становятся активными только после образования комплекса с лигандом. К этой группе принадлежат, нап-р, стероидные гормоны.

Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК ген-ю инф-ю для синтеза специф-х белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизм регуляции синтеза белка вероятно более сложный. У бактерий доказана индукция ферм-в (т. е. синтез ферментов de novo) при добавлении в пит среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование кот катализируется этими же ферм-ми, напротив, вызывает уменьшение кол-ва синтезируемых ферм-в. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления — индукция и репрессия — взаимосвязаны.

Согласно теории Жакоба и Моно в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: стр-е гены, ген-регулятор и ген-оператор. Стр-е гены опр-ют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК яв-ся основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано выше, служит матрицей для биосинтеза белка.

Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке стр-го гена или генов, регулируемых им. «Считывание» ген-го кода, т. е. формирование мРНК, начинается с промотора— участка ДНК, явл-ся точкой инициации для синтеза мРНК, и далее распространяется последовательно вдоль оператора и стр-х генов. Координированный одним оператором одиночный ген или группа стр-х генов образует оперон.

деятельность оперона нах-ся под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Поскольку стр-е гены и ген-регулятор находятся в разных участках цепи ДНК, связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осущ-ся при помощи в-ва-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфич мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Обр-е такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, след-но, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит, в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность стр-х генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связ-ся с опред-ми низкомолекулярными вещ-ми, называемыми индукторами, или эффекторами. Когда такой индуктор соединяется с репрессором, последний теряет способность связ-ся с геном-оператором, который т.о выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК.

Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Этот процесс аналогичен взаимоотношениям аллостерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом.

Лактозный оперон

В качестве примера приведен лактозный оперон бактерии Е. coli (участок ДНК), который подвержен одновременно негативному и позитивному контролю. Оперон содержит структурные гены трех ферментов, которые необходимы для утилизации лактозы, и регуляторные элементы для управления транскрипцией оперона.

Так как лактоза превращается в клетке в глюкозу, экспрессия генов лактозного оперона не имеет смысла, когда глюкоза присутствует в клетке. Действительно гены транскрибируются только в отсутствие глюкозы и в присутствии лактозы. Регуляция достигается благодаря взаимодействию двух регуляторных белков. В отсутствие лактозы lac-penpeccop блокирует участок промотора. При наличии лактозы она превращается в изомерную аллолактозу, которая связывается с белком-репрессором и тем самым вызывает диссоциацию репрессора и оператора. Тем не менее этого недостаточно для транскрипции структурных генов. Для связывания РНК-полимеразы необходим индуктор, белок-активатор катаболитных оперонов (САР от англ. catabolite activator protein), который связывается с ДНК только в комплексе с цАМФ. Сигнал голодания возникает только в отсутствие глюкозы.

Оперон — это последовательность специальных, функциональных сегментов ДНК, а также структурных генов, которые кодируют и ре­гулируют синтез определенной группы белков одной метаболической цепи, например, ферментов гликолиза. Оперон (регулируемая единица транскрипции) состоит из следующих структурных частей (специальных пocлeдoвaтeльноcтей нуклeoтидoв)

Промотор — участок ДНК, к которому присоединяется РНК-
полимераза и начинается транскрипция.

Оператор — участок промотора, связывающий белок-регулятор.

Структурные гены (цистроны) — участки ДНК, кодирующие
мРНК конкретных белков.

Терминаторный участок ДНК несет сигнал об остановке транскрипции.

Регуляция на уровне транскрипции осуществля­ется при синтезе мРНК. Средние конц индив-х мРНК, транскрибируемых с разных генов, сильно отл-ся друг от друга. Это обусловлено тем, напр-р, что мРНК-копии од­них генов разрушаются быстрее других, либо тем, что их синтез происходит медленнее. Регуляция может осуществляться при помощи белков, спо­собных связываться с ДНК, и даже при помощи коротких фрагментов РНК, которые спариваются с ДНК, предположительно блокируя места при­крепления РНК-полимеразы. Таким образом, ско­рость транскрипции может снижаться или, наобо­рот, повышаться.

В транскрибируемой матрице ДНК выделяют две главные функциональные области — кодирующую и регуляторную. Матричная РНК транскрибируется с ДНК (кодирующей белок) с помощью фермен­та РНК-полимеразы II. Регуляторная область гена обычно находится перед началом кодирующей области. Регуляторные элементы ДНК располагаются рядом с кодирующей областью (примыкают к ней), они называются cis-регуляторными элементами. Напротив, факторы транскрипции регуляторных белков, связывающихся с субэлементами, являются trans-регуляторами по отношении к гену-мишени, поскольку кодирующие их гены находятся далеко (например, на другой хромосоме).

Регуляторная область структурного гена содержит участок, называемый промотором. Этот участок примыкает к точке начала транскрипции и в большинстве случаев содержит участок около 8 пар оснований, которые включают несколько адениновых (А) и тимидиновых (Т) нуклеотидов. Этот элемент, называе­мый ТАТА-блоком, окружен участками, богаты­ми гуанином (Г) и цитозином (Ц).

У представителей эукариот не установлено полной оперонной организации генетического материала. Гены ферментов определенного метаболического цепи могут быть расположены в разных хромосомах. Они обычно не имеют системы регуляции в виде гена-регулятора, оператора и промотора, поэтому синтезированные в ядрах эукариот иРНК Моноцистронная. Регуляция активности генов в эукариот сложнее. В этом процессе участвуют сразу несколько генов-регуляторов, то есть регуляция транскрипции эукариот является комбинативной.