Применение методов генетической инженерии в животноводстве открывает перспективу изменения ряда свойств организма: повышение продуктивности, резистентности к заболеваниям, увеличение скорости роста, улучшение качества продукции и др. Животных, несущих в своем геноме рекомбинантный (чужеродный) ген, принято называть трансгенными, а ген, интегрированный в геном реципиента, – трансгеном. Продукт этого гена (белок) является трансгенным. Благодаря переносу генов у трансгенных животных возникают новые качества, а дальнейшая селекция позволяет закрепить их в потомстве и создавать трансгенные линии.
Генетический анализ родившихся трансгенных животных и полученного от них потомства показал, что, несмотря на инъекцию ДНК на ранних стадиях, в трансгенных линиях могут появляться так называемые мозаики. К мозаикам относят животных, происходящих из одной зиготы, но имеющих разные генотипы. Подсчитано, что около 30% первичных трансгенных животных, полученных методом микроинъекции ДНК, – мозаики, что затрудняет создание чистых трансгенных линий животных.
Первые трансгенные мыши с ГР были получены в 1982 г. У них отмечалось повышение скорости роста и увеличение конечной живой массы. Однако у трансгенных свиней с геном ГР (1989) увеличение роста не наблюдалось.
По данным Л.К. Эрнста (1996), у трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора гормона роста (РФ ГР) конечная живая масса была на 15,7% выше по сравнению с контрольными животными. Однако у трансгенных овец с генами Гр и РФ ГР, несмотря на повышенный уровень ГР, скорость роста не увеличивалась.
Одна из важнейших задач использования трансгенных животных в медицине – получение биологически активных соединений за счет включения в клетки организма генов, вызывающих у них синтез новых белков.
В Эдинбурге в 1992 г. были выведены трансгенные овцы с геном α-1-антитрипсина человека и β-глобулиновым промотором. Содержание этого белка у разных трансгенных овец составляло от 1 до 35 г./л, что соответствует половине всех белков в молоке. При таком уровне продукции белка может быть получено около 10 кг трансгенного белка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких. В России группой ученых под руководством Л.К. Эрнста получены трансгенные овцы с геном химозина, в 1 л молока которых содержится 200–300 мг химозина – основного компонента для производства сыра. Крупное достижение сделано учёными научного центра, в котором была создана первая клонированная овечка – Долли. Исследователи из института Рослина произвели пять поколений птиц, в яичном белке которых содержатся человеческий интерферон и miR24 антитела для борьбы с меланомой[20].
31.С начала ХХ века стали целенаправленно применять облучение и химические мутагены, слияния соматических клеток и т. д., а скрещивание и отбор стали проводить с учетом законов Менделя. При этих традиционных методах изменения непредсказуемы и обычно затрагивают многие гены.
Генноинженерные методы позволяют создавать новые генотипы и, следовательно, новые формы растений гораздо быстрее, чем классические методы селекции. Кроме того, появляется возможность целенаправленного изменения генотипа.
Генная инженерия позволяет вводить в растения гены устойчивости к различным стрессовым факторам, фитопатогенам, гербицидам и пестицидам, гены скороспелости, фиксации азота и др. Возможно также и улучшение аминокислотного состава белков растений.
Процесс получения трансгенных растений начинается с введения требуемых генов в недифференцированные клетки таким образом, чтобы они интегрировались в хромосомы. Введение чужеродных генов в клетки растений облегчается, если их клеточные стенки удаляют с помощью гидролитических ферментов - пектиназы и(или) целлюлазы, что приводит к образованию протопластов. Чужеродные гены, находящиеся в составе векторных плазмид, вводят в протопласты одним из стандартных способов с использованием эндоцитоза, стимулированного полиэтиленгликолем, электропорации, микроинъекций или бомбардировки микрочастицами, нагруженными векторной ДНК. После этого протопласты в течение нескольких дней культивируют на питательной среде для восстановления клеточных стенок и образующиеся клетки-трансфектанты используют для регенерации целых растений.
Основным направлением применения трансгеноза для генетической модификации культурных растений является повышение их устойчивости к неблагоприятным воздействиям окружающей среды, в частности вирусам и гербицидам.
Метод защиты растений от вирусов с помощью трансгенов предложен В. Шибальским в 1988 г. Сущность метода заключается во введении в геном растений трансдействующих доминантных летальных генов или, по терминологии Шибальского, "анти-генов", которые кодируют измененные мутациями белки вирусов, существенные для их воспроизводства, и путем конкурентного замещения соответствующих белков вируса дикого типа прерывают его размножение. С использованием такого подхода удалось получить очень высокую устойчивость растений к вирусу Х картофеля (PVX). В этом случае в ген репликазы PVX с помощью направленного мутагенеза вводили мутации, сопровождающиеся заменой аминокислот в консервативном участке полипептидной цепи репликазы, ассоциированном с ее каталитическим сайтом. Для экспрессии мутантного трансгена в растениях табака были характерны внутриклеточное накопление инактивированной репликазы и появление высокой устойчивости растений к заражению вирусом PVX.
Еще один подход к получению трансгенных растений, устойчивых к вирусам, основан на введении в них трансгенов, экспрессирующих в клетках моноклональные антитела, направленные против вирусных белков. С использованием такого метода создали эффективную систему защиты растений от вируса морщинистой мозаики артишока (AMCV). Для этого сначала получили панель моноклональных антител к вирусу AMCV и отобрали гибридомы, продуцирующие антитела, которые взаимодействуют с консервативными участками белка оболочки вируса. Клетки гибридомы использовали для конструирования библиотеки кДНК, из которой выделили последовательности нуклеотидов, кодирующие полноразмерные тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов G класса 2b.
С помощью ПЦР и универсальных праймеров амплифицировали вариабельные участки этих последовательностей (VH и VL), которые далее клонировали в экспрессирующем векторе E. coli, что сопровождалось образованием полипептидов VH и VL, соединенных линкерным пептидом (антитела scFV). После отбора клонов, продуцирующих высокоаффинные антитела к вирусному антигену (scFV), объединенные таким образом гены VH-VL помещали в экспрессирующий вектор и использовали для получения трансгенных растений табака Nicotiana bentamiana. Трансгенные растения содержали в своих клетках до 0.1% антител от суммарного белка и оказались устойчивыми к AMCV-инфекции, но не к вирусу мозаики цветной капусты (CMV), что указывало на специфический характер их резистентности.
Трансгенные растения сорго, устойчивые к гербицидам, получали бомбардировкой незрелых эмбрионов на стадии зиготы микрочастицами золота (диаметр частиц - 1,5-3,0 мкм). В таком случае микрочастицы погружали в раствор экспрессирующего вектора, высушивали и "выстреливали" в клетки-мишени, добиваясь при этом высоких результатов трансфекции.
В настоящее время не вызывает сомнений, что многие продукты, потребляемые с фруктами, овощами и злаками, могут проявлять фармакологические эффекты и блокировать развитие сердечно-сосудистых, раковых и других заболеваний. К таким природным соединениям растений относятся сульфорафан из брокколи, резвератрол из винограда, генистеин из сои, эпигаллокатехин-3-галлат из зеленого чая.
Ранее было практически невозможно с помощью селекции создать растения с повышенным содержанием витаминов. Однако с развитием биохимии растений стало более ясным, какие метаболические пути являются критическими для биосинтеза витаминов. Например, для синтеза β-каротина (провитамина А) в растениях необходима фитоен-синтетаза. Этот фермент участвует в конденсации двух молекул геранил-геранил дифосфата. Ген фитоен-синтетазы из нарцисса введен в рис и экспрессирован в эндосперме риса. Таким образом, получен «золотой рис», который может помочь 2 млрд. человек, страдающих от дефицита витамина А, для которых рис – основная пища. Получены трансгенные растения рапса (канолы), экспрессирующие ген фитоен-синтетазы, в семенах которых значительно повысилось содержание каротиноидов. Показана экспрессия этого же фермента в клубнях картофеля, что приводило к повышенному синтезу каротиноидов и лютеина.
Недавно получены трансгенные растения земляники с повышенным синтезом L-аскорбиновой кислоты. Эти растения отличались суперэкспрессией гена НАДФ-зависимой Д-галактуронат-редуктазы (GalUR). Созданы растения сои с повышенным в пять раз содержанием витамина Е в семенах. Получены растения арабидопсиса с повышенным содержанием фолатов за счет экспрессии в них бактериального гена ГТФ-циклогидролазы-1 (EcGCH).
Конструирование трансгенных растений – продуцентов целевых белков
Растения являются удобной, безопасной и экономически выгодной альтернативой для продукции различных белков, вакцин и антител по сравнению с системами экспрессии на основе микроорганизмов, культур животных клеток или трансгенных животных. За последние 20 лет множество ценных белков эффективно экпрессировано в растениях. Это белки человеческой сыворотки, регуляторы роста, антитела, вакцины, промышленные ферменты, биополимеры и реагенты для молекулярной биологии. Растительные системы имеют перспективы успешного использования для производства рекомбинантных белков в промышленном масштабе.
Рекомбинантные белки, экспрессируемые в растениях
Первым фармацевтически значимым белком, экспрессированным в растениях табака и подсолнечника в 1986 г., явился человеческий гормон роста. С тех пор множество других ценных белков были синтезированы в самых различных растениях.
Среди разнообразия рекомбинантных белков, продуцируемых растениями есть белки, используемые в молекулярно-биологических исследованиях (авидин), молочные белки, используемые в качестве пищевых добавок (казеин) и белки-полимеры для медицинских и промышленных целей (коллаген и эластин). Ценные биологически активные пептиды можно получать, встраивая их в состав запасных белков семян. Так, последовательность ДНК, кодирующая пентапептидный нейрогормон животных лейэнкефалин была встроена в ген 2S альбумина запасного белка семян Arabidopsis thaliana. Экспрессия этого гена в трансформированных растениях рапса и арабидопсиса позволила получить их семена с высоким содержанием рекомбинантного белка. Целевой пептид легко выделялся из рекомбинантного белка с помощью специфического протеолитического расщепления.
32. Геном прокариот
Основной чертой молекулярной организации прокариот является отсутствие в их клетках ядра, отгороженного ядерной мембраной от цитоплазмы. Отсутствие ядра является лишь внешним проявлением особой организации генома у прокариот.
Геном прокариот построен очень компактно. Количество некодирующих последовательностей нуклеотидов минимально. Многие механизмы регуляции экспрессии генов, использующиеся у эукариот, никогда не встречаются у прокариот. Простота строения генома прокариот объясняется их упрощенным жизненным циклом.
Ген — единица наследственной информации, занимающая определенное положение в геноме или хромосоме и контролирующая выполнение определенной функции в организме. По результатам исследования прокариот, главным образом Е. сoll, ген состоит из двух основных элементов: регуляторной части и собственно кодирующей части. Регуляторная часть гена обеспечивает первые этапы реализации генетической информации, заключенной в структурной части гена; структурная часть гена содержит информацию о структуре кодируемого данным геном полипептида. Количество некодирующих последовательностей в структурной части гена у прокариот минимально. 5'-конец прокариотического гена имеет характерную организацию регуляторных элементов, особенно на расстоянии 50 — 70 н.п. от точки инициации транскрипции. Этот участок гена называют промотором. Он важен для транскрипции гена, но сам в РНК не транскрибируется. Противоположный 3'-конец — терминаторная область, необходимая для тер-минации транскрипции. В РНК он также не транскрибируется. Транскрипция начинается со стартовой точки (+1).
Последовательности ДНК, являющиеся сигналами остановки транскрипции, находятся на 3'-конце гена и называются транскрипционными терминаторами. Они содержат последовательности, которые в транскрибируемой РНК формируют структуру шпильки.
Кроме хромосомы у большинства бактерий существуют другие способные к автономной репликации структуры — плазмиды. Это двуцепочечные кольцевые ДНК размером от 0,1 до 5% размера хромосомы, несущие гены, необязательные для клетки-хозяина, или гены, необходимые лишь в определенной среде. Именно такие внехромосомные элементы и содержат гены, которые придают клеткам наследуемую устойчивость к одному или нескольким антибиотикам. Они получили название факторов резистентности, или К-факторов. Другие плазмиды определяют болезнетворность патогенных бактерий, например патогенных штаммов Е. соli, возбудителей чумы и столбняка. Третьи — определяют способность почвенных бактерий использовать необычные источники углерода, например углеводороды нефти.
У прокариот (рис. 82) основным типом организации генов являются опероны (например, лактозный оперон кишечной палочки Е. coli).
Оперон Е. coli — это группа структурных генов А, В, С, расположенных друг за другом, которые имеют общий промотор, оператор (нуклеотидные последовательности промотора и оператора перекрываются) и терминатор. Они участвуют в одном метаболическом цикле (в данном случае расщепление лактозы до глюкозы и галактозы) и регулируются координированно. Структурные гены в составе оперона находятся под контролем оператора. Регуляция оперона осуществляется геном-регулятором (см. рис. 84).
33. Молекулярная организация генов и геномов эукариот.
Главная количественная особенность генетического материала эукариот - наличие избыточной ДНК. Геном – количество ДНК, находящееся в гаплоидном наборе хромосом данного вида.
Высокоповт. послед-ти – сателитные ДНК – короткие тандемные повторы длинной 1-2 н.п, организованы в протяженные блоки. Содержание сат-ДНК 5-50% от суммарной ДНК. Свойства сателлитов: 1) быстрая и точная реасоциация в процессе ренатурации ДНК. 2) простоя первичная структура – базовая последовательность 5-7 нуклеотидов. 3) множество копий, нахождение в составе хромосом в виде тандемно расположенных протяжных кластеров. 4) пурин-перимединовая симметрия в распределении нуклеотидов по цепи ДНК. 5) концентрирование в процентромерном гетерохроматине.
Умер. повт. посл-ти. 1)гены домашнего хозяйства – гены гистоны, тРНК и рРНК. Построены из идентичных копий, тандемно повторяются. Сгруппированы в одной или нескольких районах для комбинированного синтеза. 2)гены, кодирующие гомологичные белки со сходными функциями: актины, табулины, глобулины, иммуноглобулины, гены теплового шока. Собраны в кластеры, специализированы. 3)подвижные генетические элементы (МГЭ) рассеяны по геному.
Выделяют два основных класса подвижных ген эукариот:
Транспозоны —участки ДНК организмов, способные к передвижению (транспозиции) и размножению в пределах генома. Транспозоны также известны под названием «прыгающие гены» и являются примерами мобильных генетических элементов. Транспозоны формально относятся к так называемой некодирующей части генома — той, которая в последовательности пар оснований ДНК не несёт информацию об аминокислотных последовательностях белков, хотя некоторые классы мобильных элементов содержат в своей последовательности информацию о ферментах, транскрибируются и катализируют передвижения. У разных видов транспозоны распространены в разной степени: так, у человека транспозоны составляют до 45 % всей последовательности ДНК, у плодовой мухи Drosophila melanogaster часть мобильных элементов составляет лишь 15-20 % всего генома.
Ретротранспозоны —мобильные генетические элементы, которые применяют метод «копировать и вставить» для распространения в геноме животных. По крайней мере 45 % генома человека составляют ретротранспозоны и их производные. Процесс передвижения включает промежуточную стадию молекулы РНК, которая считывается с участка ретротранспозона и которая затем, в свою очередь, используется как матрица для обратной транскрипции в последовательность ДНК. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома.
Избыточность генома эукариот объясняется также экзон-интронной организацией большинства эукариотических генов, при которой значительная часть транскрибированной РНК удаляется в ходе следующего за синтезом процессинга и не используется для кодирования аминокислотных последовательностей белков.
Большую часть генома эукариот составляют подвижные генетические элементы, которые способны перемещаться в пределах хромосомы.
В эукариотических клетках внехромосомная ДНК представлена генетическим аппаратом органелл - митохондрий и пластид, а также нукл. послед-тями, не являющимися жизненно необходимыми для клетки (вирусоподобными частицами). Наследственный материал органелл находится в их матриксе в виде нескольких копий кольцевых молекул ДНК, не связанных с гистонами. Внехромосомная ДНК составляет менее 1% всей клеточной ДНК.
Геном эукариот составляют уникальные и повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Содержание уникальных последовательностей в геноме, варьирует у разных организмов, и их доля составляет 15-98% от всей ДНК. Несмотря на то, что во фракцию уникальных последовательностей попадают многие структурные гены, большая часть уникальных последовательностей является некодирующей и обычно не заключает в себе генетической информации в общепринятом значении этого термина: не кодирует функционально значимые полипептидные цепи или РНК. Примером таких уникальных последовательностей являются интроны, общий размер которых, как правило, на порядок и более превышает суммарный размер экзонов содержащих их генов.
В общих чертах строение гена про- и эукариот в принципе одинаково. Ген эукариот так же как и у прокариот функционирует только совместно с регуляторными зонами. Но такой тандем у эукариот не называется опероном. Ген эукариот представляет собой в основном кодирующую часть ДНК, а регуляторные зоны – не кодирующую ДНК. Также как и у прокариот, рассмотрим не только строение самого гена – кодирующей его части, но и обслуживающие его элементы – регуляторные зоны.
1. Ген (кодирующая часть) состоит из: экзонов, интронов,
регуляторные участки гена содержат: стартовый кодон – сайт (место) начала транскрипции, терминатор – сайт окончания транскрипции, лидерную последовательность, трейлерную последовательность, промотор, контролирующие зоны располагаются вблизи от обслуживаемого гена, модуляторы (энхансеры, сайленсеры) – располагаются вдали от гена.
Некоторые исследователи объединяют контролирующую зону и модуляторы в одну область – регуляторную область.
Кодирующая часть гена эукариот имеет несколько существенных отличий от аналогичной области прокариот. Отметим два из них.
1. Как правило, кодирующая область представлена не несколькими генами, а одним. Каждый ген у эукариот имеет свою регуляторную область.
2. Если в генах прокариот не кодирующие участки практически отсутствуют, то ген эукариот имеет мозаичное строение – в нём чередуются участки, несущие информацию о последовательности аминокислот в белке и не несущие её. Участки, несущие информацию носят название экзоны, не несущие называются интроны. Число интронов у различных организмов различно.
Мозаичное строение чаше всего встречается в генах, кодирующих белки (с этих генов транскрибируется иРНК) и тРНК. Интересно, что сходные гены у разных организмов одного вида часто имеют одинаковое число интронов в одних и тех же позициях. Обычно длина интронов превышает длину экзонов.
Кодирующая часть гена представляет единицу транскрипции.
Что касается регуляции, то необходимо пояснить, что существуют два термина – регуляторные области (зоны, участки и т.д.) и регуляторные гены (гены-регуляторы).
Регуляторные области – это участки ДНК на которых осаждаются белки-регуляторы. Их функция – регуляция транскрипции. Для простоты эти зоны подразделяют на два типа. Мы их отметили выше, но всё же повторим.
а. Зоны располагающиеся близко от гена, который они контролируют - контролирующие зоны.
б. Зоны располагающиеся далеко от контролируемого гена - модуляторы.
Гены-регуляторы – это обычные структурные гены, кодирующие иРНК несущую информацию о строении какого-либо белка-регулятора. Некоторые из этих генов транскрибируют специальные регуляторные РНК.
Рассмотрим строение регуляторных областей. Их несколько. На 5’- конце гена располагается сайт начала транскрипции. На 3’- конце располагается сайт окончания транскрипции (терминатор). Перед сайтом начала транскрипции, также как и у прокариот, располагается лидерная последовательность, а перед сайтом окончания транскрипции находится трейлерная последовательность. Функциональное значение этих участков аналогично таким же участкам у прокариот. Если у прокариот транскрипцию всех генов осуществляла один фермент РНК- полимераза, то у эукариот существуют три типа РНК-полимераз, которые обеспечивают транскрипцию разных эукариотических генов (генов транскрибирующих иРНК, тРНК и рРНК). У большинства генов эукариот, как и у прокариот, эти ферменты связываются с участком.
Трейлерная последовательность
Лидерная последовательность
Сайт конца транскрипции
Сайт начала транскрипции, расположенный на 5’- конце ДНК перед сайтом инициации. Этот участок носит название промотор. Однако, в отличии от прокариот одна РНК-полимераза соединиться с промотором не способна. Прежде чем связаться с промотором РНК-полимераза эукариот соединяется с многочисленными белками (их около 50), которые способствуют её прикреплению к промотору. Эти белки называются факторами транскрипции, а образовавшийся комплекс РНК-полимеразы с факторами транскрипции именуется комплекс транскрипции (или транскрипционный комплекс). Факторы транскрипции (их так же можно назвать регуляторными белками) активируют РНК-полимеразу и кодируются регуляторными генами.
Образование комплекса транскрипции и его активность в свою очередь контролируют ещё два типа белков-регуляторов. Первый тип белков осаждается на регуляторные (зоны) последовательности ДНК, которые располагаются, как правило, рядом с промотором. Эти белки ускоряют или тормозят образование транскрипционного комплекса. Регуляторные последовательности имеют различные названия. Чаще всего их объединяют термином – контролирующие зоны или цис-регуляторные элементы. К этой зоне относится лидерная последовательность, промотор и регуляторные зоны. располагающиеся рядом с промотором - рядом расположенные области. К контролирующим зонам присоединяются различные регуляторные белки, которые влияют на начальное связывание РНК-полимеразы с промотором. Эти белки носят специальное название – факторы транскрипции.
Второй тип регуляторных последовательностей усиливает или тормозит движение транскрипционного комплекса по гену. У эукариот эти участки часто расположены далеко от контролируемого ими гена: - впереди от 5’- конца кодирующей области, но за несколько тысяч пар нуклеотидов от кодирующего участка, в самой кодирующей области или позади неё. В некоторых случаях их выявляют на других хромосомах.
34. Организмы адаптируются к меняющимся условиям окр среды путём изменения экспрессии (скорости транскрипции) генов. Этот процесс включает взаимодействие спец-х белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. При этом может происходить включение или выключение транскрипции. Эукариотические клетки используют тот же самый принцип, хотя в регуляции реализуются и некоторые другие более сложные механизмы.
Контроль экспрессии генов осуществляется на следующих уровнях:
· на уровне транскрипции (контролируется время и характер транскрипции гена)
· на уровне процессинга первичного транскрипта
· при отборе зрелых мРНК для их транспорта в цитоплазму
· на уровне трансляции - отбор в цитоплазме мРНК для трансляции на рибосомах
· на уровне деградации - избирательная дестабилизация определенных типов мРНК в цитоплазме
· на уровне активности белка - селективная активация, инактивация или компартментация молекул белка после их синтеза.
Экспрессия генов как у прокариот, так и у эукариот регулируется при помощи целого ряда механизмов.
Концепция оперона в регуляции экспрессии генов у прокариот. Ген обычно неактивен, но когда необходим определенный белок, конкретный ген «активируется», что обусловливает производство этого белка. Таким образом, клетки имеют механизм, контролирующий количество любого белка в определенное время. Синтез белков регулируется генетическим аппаратом, а также факторами внутренней и внешней среды.
Во всех клетках экспрессия генов контролируется регуляторными белками, кот связываются с определенным участком ДНК и т.о стимулируют пли подавляют транскрипцию гена. Действие регуляторных белков обратимо и, как правило, требует присутствия лиганда. Как для белков, так и для участков ДНК, с кот они связ-ся, исп-ся различные наименования в зависимости от принципа действия. Регуляторный белок, который влияет на транскрипцию генов, называют фактором транскрипции. Белок, подавляющий транскрипцию, называют репрессором, а стимулирующий — индуктором. Послед-ти ДНК, с кот связ-ся регуляторные белки, наз-ся регуляторными элементами. У прокариот регул-е элементы, кот служат участками связывания РНК-полимеразы, наз-ют промоторами, в то время как для репрессорных участков связывания употребляется название оператор. Регуляторные элементы, связывающие активирующие факторы, называют энхансерами (усилитель), в то время как элементы, связывающие негативные (ингибирующие) факторы, — сайленсерами (успокоитель).
Многочисленные известные регуляторные белки можно разделить по механизму действия на четыре группы. Негативная ген-я регуляция, т. е. выключение соответствующих генов, может вызываться репрессорами. Некоторые репрессоры связываются с ДНК только в отсутствие спец-го лиганда. Комплекс репрессора с лигандом в этом случае теряет способность к связыванию и оставляет свободным участок промотора для присоединения РНК-полимеразы. Часто свободный от лиганда репрессор не может связываться с ДНК, т. е. транскрипция подавляется только в присутствии лигандов. Аналогично при позитивной ген-й регуляции можно различать 2 случая. Если связывается только свободный индуктор, транскрипция подавляется соответствующими лигандами. Напротив, многие индукторы становятся активными только после образования комплекса с лигандом. К этой группе принадлежат, нап-р, стероидные гормоны.
Общую теорию регуляции синтеза белка разработали Ф. Жакоб и Ж. Моно. Сущность этой теории сводится к «выключению» или «включению» генов как функционирующих единиц, к возможности или невозможности проявления их способности передавать закодированную в структурных генах ДНК ген-ю инф-ю для синтеза специф-х белков. Эта теория, доказанная в опытах на бактериях, получила широкое признание, хотя в эукариотических клетках механизм регуляции синтеза белка вероятно более сложный. У бактерий доказана индукция ферм-в (т. е. синтез ферментов de novo) при добавлении в пит среду субстратов этих ферментов. Добавление конечных продуктов реакции, образование кот катализируется этими же ферм-ми, напротив, вызывает уменьшение кол-ва синтезируемых ферм-в. Это последнее явление получило название репрессии синтеза ферментов. Оба явления — индукция и репрессия — взаимосвязаны.
Согласно теории Жакоба и Моно в биосинтезе белка у бактерий участвуют по крайней мере 3 типа генов: стр-е гены, ген-регулятор и ген-оператор. Стр-е гены опр-ют первичную структуру синтезируемого белка. Именно эти гены в цепи ДНК яв-ся основой для биосинтеза мРНК, которая затем поступает в рибосому и, как было указано выше, служит матрицей для биосинтеза белка.
Синтез мРНК на структурных генах молекулы ДНК непосредственно контролируется определенным участком, называемым геном-оператором. Он служит как бы пусковым механизмом для функционирования структурных генов. Ген-оператор локализован на крайнем отрезке стр-го гена или генов, регулируемых им. «Считывание» ген-го кода, т. е. формирование мРНК, начинается с промотора— участка ДНК, явл-ся точкой инициации для синтеза мРНК, и далее распространяется последовательно вдоль оператора и стр-х генов. Координированный одним оператором одиночный ген или группа стр-х генов образует оперон.
деятельность оперона нах-ся под контролирующим влиянием другого участка цепи ДНК, получившего название гена-регулятора. Поскольку стр-е гены и ген-регулятор находятся в разных участках цепи ДНК, связь между ними, как предполагают Ф. Жакоб и Ж. Моно, осущ-ся при помощи в-ва-посредника, оказавшегося белком и названного репрессором. Образование репрессора происходит в рибосомах ядра на матрице специфич мРНК, синтезированной на гене-регуляторе. Репрессор имеет сродство к гену-оператору и обратимо соединяется с ним в комплекс. Обр-е такого комплекса приводит к блокированию синтеза мРНК и, след-но, синтеза белка, т.е. функция гена-регулятора состоит, в том, чтобы через белок-репрессор прекращать деятельность стр-х генов, синтезирующих мРНК. Репрессор, кроме того, обладает способностью строго специфически связ-ся с опред-ми низкомолекулярными вещ-ми, называемыми индукторами, или эффекторами. Когда такой индуктор соединяется с репрессором, последний теряет способность связ-ся с геном-оператором, который т.о выходит из-под контроля гена-регулятора, и начинается синтез мРНК.
Это типичный пример отрицательной формы контроля, когда индуктор, соединяясь с белком-репрессором, вызывает изменения его третичной структуры настолько, что репрессор теряет способность связываться с геном-оператором. Этот процесс аналогичен взаимоотношениям аллостерического центра фермента с эффектором, под влиянием которого изменяется третичная структура фермента и он теряет способность связываться со своим субстратом.
Лактозный оперон
В качестве примера приведен лактозный оперон бактерии Е. coli (участок ДНК), который подвержен одновременно негативному и позитивному контролю. Оперон содержит структурные гены трех ферментов, которые необходимы для утилизации лактозы, и регуляторные элементы для управления транскрипцией оперона.
Так как лактоза превращается в клетке в глюкозу, экспрессия генов лактозного оперона не имеет смысла, когда глюкоза присутствует в клетке. Действительно гены транскрибируются только в отсутствие глюкозы и в присутствии лактозы. Регуляция достигается благодаря взаимодействию двух регуляторных белков. В отсутствие лактозы lac-penpeccop блокирует участок промотора. При наличии лактозы она превращается в изомерную аллолактозу, которая связывается с белком-репрессором и тем самым вызывает диссоциацию репрессора и оператора. Тем не менее этого недостаточно для транскрипции структурных генов. Для связывания РНК-полимеразы необходим индуктор, белок-активатор катаболитных оперонов (САР от англ. catabolite activator protein), который связывается с ДНК только в комплексе с цАМФ. Сигнал голодания возникает только в отсутствие глюкозы.
Оперон — это последовательность специальных, функциональных сегментов ДНК, а также структурных генов, которые кодируют и регулируют синтез определенной группы белков одной метаболической цепи, например, ферментов гликолиза. Оперон (регулируемая единица транскрипции) состоит из следующих структурных частей (специальных пocлeдoвaтeльноcтей нуклeoтидoв)
Промотор — участок ДНК, к которому присоединяется РНК-
полимераза и начинается транскрипция.
Оператор — участок промотора, связывающий белок-регулятор.
Структурные гены (цистроны) — участки ДНК, кодирующие
мРНК конкретных белков.
Терминаторный участок ДНК несет сигнал об остановке транскрипции.
Регуляция на уровне транскрипции осуществляется при синтезе мРНК. Средние конц индив-х мРНК, транскрибируемых с разных генов, сильно отл-ся друг от друга. Это обусловлено тем, напр-р, что мРНК-копии одних генов разрушаются быстрее других, либо тем, что их синтез происходит медленнее. Регуляция может осуществляться при помощи белков, способных связываться с ДНК, и даже при помощи коротких фрагментов РНК, которые спариваются с ДНК, предположительно блокируя места прикрепления РНК-полимеразы. Таким образом, скорость транскрипции может снижаться или, наоборот, повышаться.
В транскрибируемой матрице ДНК выделяют две главные функциональные области — кодирующую и регуляторную. Матричная РНК транскрибируется с ДНК (кодирующей белок) с помощью фермента РНК-полимеразы II. Регуляторная область гена обычно находится перед началом кодирующей области. Регуляторные элементы ДНК располагаются рядом с кодирующей областью (примыкают к ней), они называются cis-регуляторными элементами. Напротив, факторы транскрипции регуляторных белков, связывающихся с субэлементами, являются trans-регуляторами по отношении к гену-мишени, поскольку кодирующие их гены находятся далеко (например, на другой хромосоме).
Регуляторная область структурного гена содержит участок, называемый промотором. Этот участок примыкает к точке начала транскрипции и в большинстве случаев содержит участок около 8 пар оснований, которые включают несколько адениновых (А) и тимидиновых (Т) нуклеотидов. Этот элемент, называемый ТАТА-блоком, окружен участками, богатыми гуанином (Г) и цитозином (Ц).
У представителей эукариот не установлено полной оперонной организации генетического материала. Гены ферментов определенного метаболического цепи могут быть расположены в разных хромосомах. Они обычно не имеют системы регуляции в виде гена-регулятора, оператора и промотора, поэтому синтезированные в ядрах эукариот иРНК Моноцистронная. Регуляция активности генов в эукариот сложнее. В этом процессе участвуют сразу несколько генов-регуляторов, то есть регуляция транскрипции эукариот является комбинативной.
