Примечания Любая ДНК и РНК в растворе (коллоидном) это не кислота, а соль нуклеиновой кислоты. И катион у не тот же, что и у соли, в присутствии которой она осаждалась.
Ацетаты, цитраты, сульфаты являются космотропными солями, цианаты – хаотропные соли. Для осаждения ДНК из растворов, содержащих SDS, чаще всего применяется NaCl, поскольку другие соли высаживают SDS существенно лучше.
Рабочие концентрации других соосадителей: тРНК – 5–10 мкг/мл, линейный полиакриламид – 10–20 мкг/мл.
Вместо этанола можно использовать изопропанол. В этом случае добавляется не 2,5 объма, а 1 объм. Осаждение изопропанолом имеет одно преимущество перед этанольным – пробирки могут быть меньшего объма. Основной недостаток – изопропанол менее летуч и последующая промывка 70% этанолом является обязательной.
Осаждение спиртами ДНК, особенно низкомолекулярной и в малой концентрации, улучшается если добавить MgCl2 до конечной концентрации 10мM.
Было показано, что увеличение времени инкубации, равно как и понижение температуры, не оказывает существенного влияния на эффективность осаждения ДНК.
Это справедливо для растворов ДНК с концентрацией более 20 нг/мл, однако такой подход по традиции часто соблюдается. Когда ДНК очень мало наиболее заметный эффект дат увеличение времени центрифугирования до 1 часа при +4oС, а не время нахождения ДНК «под спиртом» или низкая температура инкубации, вплоть до –70oС.
Пробирку нужно заполнять 70% спиртом не более чем на 2/3. Хорошо будет перед сливанием 70% спирта центрифугировать пробу в течение 2–3 мин при максимальной скорости центрифуги: осадки хоть и плотные, но их можно случайно вылить вместе с разбавленным спиртом. Такое иногда случается, особенно если ДНК плохо очищена от белков, без которых она никогда не существует in vivo. В клетке ДНК – это всегда ДНП, и вне клетки также покрыта белковыми молекулами (вирус, бактериофаг). В работе с ДНК качественные показатели важнее количественных.
8. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ ПРЕПАРАТОВ ДНК, РНК И
БЕЛКОВ
Довольно часто количественную и качественную оценку препарату выделенной ДНК в первом приближении дают при гель-электрофорезе, следующем, как правило, сразу за процедурой выделения. Для этого визуально сравнивают на соседних дорожках геля интенсивность свечения в ультрафиолете полученного образца с образцом известной концентрации.
Определить концентрацию ДНК, а также степень е чистоты, можно с помощью спектрофотометра, что точнее и быстрее. Для этого измеряют оптическую плотность раствора ДНК при длине волны 260 нм. Одна (каждая) оптическая единица соответствует концентрации ДНК в 50 мкг/мл. Для расчта можно воспользоваться калькулятором на интернет-ресурсе MOLBIOL.RU (http://www.molbiol.ru) или других подобных порталах.
Спектрофотометрия (абсорбционная) – физико-химический метод исследования растворов и тврдых веществ, основанный на изучении спектров поглощения в ультрафиолетовой (200–400 нм), видимой (400– 760 нм) и инфракрасной (760 нм) областях спектра. Основная зависимость, изучаемая в спектрофотометрии – зависимость интенсивности поглощения падающего света от длины волны. В сооответствии с законом Бугера– Ламберта–Бера оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации поглощающего вещества. Нуклеиновые кислоты (НК) поглощают УФ излучение в области 240–290 нм с максимумом при 260 нм.
Хромофорами служат азотистые основания НК, особенно пиримидиновые.
Пиримидины поглощают УФ свет примерно в 10–20 раз интенсивнее, чем хромофоры белковых молекул – триптофан, тирозин и фенилаланин.
Для оценки чистоты препарата ДНК, свободного от РНК, проводят измерения оптической плотности раствора при длинах волн 260, 280 и 235 нм, т.е. на максимумах поглощения растворов ДНК, белков и полисахаридов, соответственно. Значение соотношения А260/280 для чистой ДНК должно быть больше 1,8, значение А260/235 должно быть больше, чем 2,2. Загрязнение полисахаридами характерно, главным образом, для препаратов растительной ДНК. В состав лигнина, в отличие от других углеводов, входят ароматические группировки атомов, и поэтому лигнин поглощает УФ излучение.
Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК Нижний предел концентрации ДНК, которую можно определить спектрофотометрически, составляет 0,1 мкг/мл. На определение обычно берут аликвоту (лат. aliquoties – несколько частей, кратный) исследуемого раствора ДНК, к примеру, 1 мкл и разбавляют в 100 и более раз.
Затем пересчитывают полученное значение концентрации раствора.
Важно, чтобы в разведнном образце было более 10 нг ДНК. Для сравнения, при гель-электрофорезе также можно визуализировать полоску, содержащую от 10 нг ДНК. В образце ДНК не должно быть РНК.
Материалы и оборудование Геномная ДНК из бактерий, клеток крови или тканей кукурузы с неизвестной концентрацией, спектрофотометр, образец ДНК любого происхождения с известной концентрацией.
Растворы - Раствор ДНК с неизвестной концентрацией в буфере ТЕ.
- Раствор ДНК фага лямбда в буфере ТЕ с концентрацией 1 мг/мл.
Взять микропипеткой на анализ 1 мкл образца полученной ДНК и разбавить препарат, добавив 130 мкл буфера ТЕ, содержащего 100мМ NaCl а. Объм образца делают равным 130 мкл, чтобы кривизна поверхности жидкости не влияла на измерения.
Поместить образец разбавленной ДНК в «маленькую» (100 мкл) ячейку.
Измерить поглощение А260. Полученное значение должно лежать в пределах 0,005–2,5 б. В противном случае нужно разбавлять или концентрировать ДНК в.
Рассчитать концентрацию ДНК, используя коэффициент пересчта из табл. 1 по формуле: С[мкг/мл] = А260 K 5. Измерить поглощение А280 и А235, чтобы оценить степень очистки ДНК от примеси белков и полисахаридов. Отношение 260/280, также как и 260/ должно быть больше чем 1,8. Для чистой ДНК характерны значения А260/А280 = 1,8–1,9 и А260/А235 = 2,2–2,5. Для чистой РНК значение А260/А = 1,9–2,0 д.
Точность измерения падает при слишком больших и слишком малых значениях А260 из-за нарушений закона светопоглошения. Ошибка при значении 0,05 составляет 18%, при значении 0,1–1,0 1%. Измерения при значениях свыше 2,5 недостоверны.
Концентрируют ДНК путм е переосаждения спиртом
Для олигонуклеотидов, поглощение которых ощутимо зависит от их состава, существуют специальные расчты.
Эти значения достоверны, если измерение проводится в буферном растворе (например, ТЕ) при нейтральном значении pH.
. Определение концентрации белка по собственной флуоресценции Спектрофотометрические методы определения белка основаны на измерении поглощения или испускания света в ультрафиолетовой области спектра. Для абсорбционой УФ-спектрофотометрии белков существуют некоторые проблемы, поэтому гораздо чаще определяют связавшиеся с определнными красителями белки колориметрически в видимой области спектра (см. тему 10), либо в УФ свете измеряют эмиссию.
Растворы белка обладают поглощением в интервалах длин волн 270– 290 и 200–225 нм. Поглощение при 280 нм определяется присутствием в молекуле белка ароматических аминокислот – тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина. Абсорбция при =210 нм, обусловленная пептидными связями в белках, практически в 20 раз выше, чем при 280 нм.
Поскольку поглощение в ультрафиолетовой области при 210 нм обусловлено в основном пептидными связями, то для разных белков величина поглощения различается незначительно. Определение общего белка в сыворотке крови с помощью прямой фотометрии при длине волны 210 нм обеспечивает получение результатов, сравнимых с биуретовым методом и методом Кьельдаля. Однако данный метод применяется сравнительно редко из-за необходимости использования кювет, не поглощающих при 210 нм, и монохроматора, что удорожает метод.
В сравнении с фотометрией при =210 нм точность и специфичность методов определения белков, основанных на поглощении при =280 нм, невелика, поскольку содержание тирозина и триптофана может колебаться в различных белках. Кроме того, присутствие в сыворотке крови свободных аминокислот – триптофана и тирозина, а также мочевой кислоты и билирубина, поглощающих при 280 нм, вносит определнную погрешность.
В связи с этим данный метод не используют для прямого определения содержания общего белка в сыворотке крови. Однако для препаратов белка с той или и иной степенью очистки его удобно использовать (прил. 17).
Примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов будет влиять на определение.
Кроме адсорбции в УФ свете измеряют также эмиссию. Приведнный ниже метод полезен при очень низких концентрациях белка, имеющегося в малых количествах. Главное, что он не требует предварительного окрашивания полученного образца белка (необратимого, см. тему 10), так как раствор белка обладает собственной флуоресценцией.
Получить спектр флуоресценции раствора исследуемого белка с длиной волны возбуждения 280 нм, сканирование эмиссии в интервале 310–360 нм. Режим сканирования (флуоресценция, по регистрации, коррекция полная, шаг 1 нм) определяется по значению в максимуме флуоресценции при выключенной коррекции (10–90 единиц). Если в области 330–340 нм (при полной коррекции) наблюдается пик интенсивности флуоресценции, то определение концентрации возможно, в противном случае концентрация белка слишком низкая, и его нужно концентрировать.
Записать значение интенсивности флуоресценции I и длину волны эмиссии в максимуме кривой флуоресценции. Снять спектр для буфера в отсутствии белка с теми же параметрами. Записать значение интенсивности флуоресценции Io на найденной длине волны. Вычислить значение I–Io.
Используя буферный раствор, приготовить методом последовательного разведения растворы белка для калибровки с концентрациями от мг/мл до 3 10-6 мг/мл с шагом в 1 порядок, каждый объмом по 2,7 мл. Для каждого раствора определить I–Io, затем, используя MS Excel построить калибровочный график зависимости концентрации белка от I–Io.
По калибровочному графику определить концентрацию раствора исследуемого белка.
