Примечания По нашему опыту лучше использовать песок, мацерирующий ткани растений быстрее. Примесь песка или Al2O3 уйдет из образца при первом центрифугировании.
После экстракции белков фенолом и хлороформом всегда уменьшается объм водной фазы. Небольшое нарушение объмной пропорции 1:1 на деле не очень важно, однако на практике лучше этим не пренебрегать. Если водной фазы останется слишком мало (меньше 100 мкл) требуется перед хлороформом добавить ТЕ-буфер до исходного объма, иначе потом будет неудобно отбирать верхнюю фазу и потери ДНК возрастут.
При методе с использованием SDS получается высокомолекулярная ДНК со средним размером фрагментов около 50 kb (kilo base pairs, тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.).
В препарате – хромосомная, хлоропластная и митохондриальная ДНК, а также РНК.
В буфере ТЕ можно хранить ДНК в холодильнике при +4 С сроком до нескольких месяцев. Для более длительного хранения ДНК в замороженном виде е растворяют в бидистиллированной или деионизованной воде. Использовать воду вместо ТЕ-буфера удобно, поскольку не будет необходимости переосаждать ДНК перед постановкой реакций, требующих ионов Mg2+, необходимых специфичным к ДНК ферментам. Однако замораживание-размораживание неизбежно ведт к одно-/двух-цепочечным разрывам в цепи ДНК. Лучше всего из буфера ТЕ исключить ЭДТА и заморозить в нм, поскольку бидистилят, к примеру, имеет слабокислый показатель pH, что для ДНК нежелательно. В глубокой заморозке при –70 С можно заложить ДНК на хранение на годы.
Работа 1.4. Концентрирование ДНК путем осаждения спиртом Наиболее часто используемый метод концентрирования ДНК – осаждение этанолом. Растворив полученный осадок в меньшем объме буферного раствора, получают более концентрированный раствор ДНК. При переосаждении ДНК спиртом происходит е дополнительная очистка.
Этиловый спирт как водоотнимающее средство снижает растворимость нуклеиновых кислот (их солей) в воде. ДНК (РНК) агрегирует в 70% этаноле в присутствии соли, нейтрализующей фосфатные группы. Агрегация НК проходит лучше при пониженной температуре и для не требуется некоторое время. Образовавшиеся агрегаты осаждают центрифугированием.
На осаждение ДНК из раствора берут 2,5 объма этанола или 1 объм изопропанола. При значительных масштабах работ в целях экономии допускается брать 0,6 объма изопропанола как минимум. Нужно помнить, что 70% – это оптимум концентрации этилового спирта для преципитации нуклеиновых кислот. Если концентрация этанола будет низкой, то ДНК в кристаллическое состояние (холестерические жидкие кристаллы) не перейдт, если высокой – в осадок вместе с ней выпадут оставшиеся белки и другие примеси. Оптимальная ионная сила раствора для осаждения ДНК составляет 0,2M NaCl; при е понижении ДНК будет преципитировать хуже.
ДНК после высаживания нужно перевести в раствор с нейтральным или слабощелочным показателем pH среды, если предполагается хранение.
Помимо спиртов для осаждения нуклеиновых кислот применяют также полиэтиленгликоль PEG, цетилтриметиламмониум бромид CTAB и другие хаотропные вещества. Стандартная процедура – спиртовое осаждение.
Методика 1. Довести концентрацию соли в препарате до 0,2М NaCl (или до 0,3M ацетата натрия), используя концентрированные стоковые растворы этих солей. Чаще всего к раствору ДНК добавляют 1/25 объма 5М NaCl или 1/10 объма 3М ацетата натрия, pH 5,2, поскольку эти растворы всегда есть под рукой у исследователя ДНК и белков.
2. Если концентрация ДНК низкая, то требуется добавить какой-либо соосадитель, например гликоген, до конечной концентрации 50 мкг/мл.
3. Прибавить к раствору ДНК 2,5 объма холодного 96% этанола, учитывая объм добавленного раствора соли.
4. Инкубировать при комнатной температуре от 5 мин и до выдерживания в течение ночи при –20oС в зависимости от концентрации ДНК.
5. Центрифугировать при максимальной скорости микроцентрифуги в течение 10 минут. (Препараты ДНК с низкой концентрацией осаждают в течение 1–2 часов в высокоскоростной центрифуге с охлаждением при скорости 27000 об/мин и постоянной температуре +4oС).
6. Промыть осадок ДНК холодным 70%-ным этанолом. Для этого перемешать содержимое переворачиванием пробирки несколько раз, слить спирт и поместить пробирку в переврнутом виде на фильтровальную бумагу, чтобы стекли остатки спирта. Подсушить осадок.
