Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту: метод химической деградации В 1976 г. А. Максамом и У. Гилбертом был разработан метод секвенирования, основанный на специфической химической деградации фрагмента ДНК, радиоактивно меченного с одного конца. Препарат меченной ДНК разделяли на четыре аликвоты и каждую обрабатывали реагентом, модифицирующим одно или два из четырех оснований. А. Максам и У. Гилберт предложили модифицировать пуриновые основания диметилсульфатом. При этом происходит метилирование адениновых остатков по азоту в положении 3, а гуаниновых - по азоту в положении 7. Обработка образца ДНК соляной кислотой при 0°С приводит к выщеплению метиладенина. Последующая инкубация при температуре 90°С в щелочной среде вызывает разрыв сахарно-фосфатной цепи ДНК в местах выщепления оснований. Обработка пиперидином приводит к гидролизу образца по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируют гидразином. Если реакцию вести в бессолевой среде, то модифицируются как цитозин, так и тимидин; если обработку вести в присутствии 2М NaCl, то модифицируется лишь цитозин. Расщепление цепи ДНК на фрагменты и в этом случае осуществляется пиперидином. Условия реакций авторы подбирали таким образом, чтобы в итоге получить полный набор субфрагментов разной длины. Последующий электрофорез в полиакриламидном геле позволяет восстановить полную структуру исследуемого фрагмента.
Секвенирование ДНК по Сэнгеру: "плюс-минус" метод (метод обрыва цепи) Первым методом прямого ферментативного секвенирования ДНК стал метод, предложенный Ф. Сэнгером и Д. Коулсоном в 1975 г. В качестве матрицы в реакции полимеразного копирования использовался одноцепочечный фрагмент ДНК, в качестве праймеров - синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые при гидролизе рестрицирующими эндонуклеазами, а в качестве фермента - фрагмент Кленова ДНК полимеразы I (PolI) из E.coli. Метод включал два этапа. Сначала в ограниченных условиях проводили полимеразную реакцию в присутствии всех четырех типов dNTP (один из них был мечен по альфа-положению фосфата), получая на выходе набор продуктов неполного копирования матричного фрагмента. Смесь очищали от несвязавшихся дезоксинуклеозидтрифосфатов и делили на восемь частей. После чего в "плюс" системе проводили четыре реакции в присутствии каждого из четырех типов нуклеотидов, а в "минус" системе - в отсутствие каждого из них. В результате, в "минус" системе терминация происходила перед dNTP данного типа, а в "плюс" системе - после него. Полученные таким образом восемь образцов разделяли с помощью электрофореза, "считывали" сигнал и определяли последовательность исходной ДНК. Этим способом была секвенирована короткая ДНК фага фХ174, состоящая из 5386 нуклеотидных пар.
Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод "терминаторов" В 1977 г. автор "плюс-минус" метода предложил еще один способ ферментативного секвенирования, получивший название метода терминирующих аналогов трифосфатов. Более мощный и более технологичный, этот способ, несколько модифицированный, применяется до сих пор. В основе метода тоже лежало ферментативное копирование с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы I из E.coli. В качестве праймеров использовали синтетические олигонуклеотиды. Специфическую терминацию синтеза обеспечивали добавлением в реакционную смесь помимо четырех типов dNTP (один из которых был радиоактивно мечен по альфа положению фосфата) еще и одного из 2',3'-дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), который способен включаться в растущую цепь ДНК, но не способен обеспечивать дальнейшее копирование из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP авторы подбирали экспериментально, так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины. Таким образом, для определения первичной структуры исследуемого фрагмента ДНК требовалось провести четыре реакции копирования: по одному типу терминаторов в каждой из реакций. После этого полученные продукты разгонялись в полиакриламидном геле на соседних дорожках и по расположению полос определялась последовательность нуклеотидов
15 Автоматическое секвенирование ДНК В основе автоматического секвенирования лежит уже упоминавшийся выше метод ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP (*). Как и классический вариант Сэнгера, автоматическое секвенирование включает две стадии: проведение терминирующих реакций и разделение продуктов этих реакций с помощью электрофореза. Как правило, автоматизирована лишь вторая стадия, т.е. разделение меченных фрагментов ДНК в ПААГ, получение спектра эмиссии флуорофоров и последующий обсчет собранных данных. Таким образом, автоматическое секвенирование идеологически отличается от современного ему ручного секвенирования только типом используемой метки. Флуоресцентную метку включают либо в праймер, либо в терминатор транскрипции согласно следующим схемам: меченный праймер (четыре разных красителя) и немеченые терминаторы; меченный праймер (один краситель) и немеченые терминаторы; меченные терминаторы (каждый тип терминатора своим красителем) и немеченый праймер. Использование меченных праймеров предполагает проведение четырех независимых реакций (отдельно с каждым из терминаторов) для каждого секвенируемого образца. Использование меченных терминаторов позволяет совместить все четыре реакции в одной пробирке. Если используется единственный краситель, то разделение продуктов сиквенсовой реакции в геле проводят на четырех разных дорожках. Использование четырех разных красок позволяет разгонять продукты реакции(й) на одной дорожке.
Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путём синтеза». При включении нуклеотида происходит детекция высвобождающихся пирофосфатов.[1] Технология была разработана Полом Ниреном (Pål Nyrén) и его студентом Мустафой Ронаги, в Королевском Техническом Институте (Стокгольм) в 1996 году.[2][3][4]
«Секвенирование путём синтеза» заключается в том, что для секвенирования одноцепочечной ДНК ферментативно синтезируют комплементарную цепочку. Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Метод позволяет секвенировать одну цепочку нуклеотидов ДНК путём синтеза комплементарной цепочки, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. Матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после реакции. Свет образуется в тот момент, когда раствор нуклеотидов соответствует первому неспаренному основанию матрицы. Последовательность растворов, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность матрицы.
Матрица одноцепочечной ДНК гибридизуется с праймером и инкубируется с ферментами ДНК-полимеразой, АТФ-сульфурилазой, люциферазой и апиразой, а также с субстратами аденозин-5´-фосфосульфатами (APS) и люциферином.
- Добавление одного из четырёх дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP)(в случае dATP добавляют dATPαS, который не является субстратом для люциферазы) инициирует следующий этап. ДНК-полимераза включает правильный комплементарный дезоксинуклеотид в цепочку. При этом стехиометрически высвобождается пирофосфат (PPi).
- Фермент АТФ-сульфурилаза количественно превращает PPi в аденозинтрифосфат (АТФ) в присутствии аденозин-5´-фосфосульфата. АТФ выступает «топливом» для фермента люциферазы, которая превращает люциферин в оксилюциферин, при этом высвобождается видимый свет, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшегося АТФ. Свет образуется в реакции, катализируемой люциферазой, регистрируется камерой и далее анализируется специальной компьютерной программой.
- Невключённые нуклеотиды и АТФ подвергаются деградации ферментом апиразой, и реакция начинается с новым нуклеотидом.
В настоящий момент существуют некоторые ограничения в применения данного способа секвенирования. Лимитирующим фактором является длина последовательности нуклеотидов, которая составляет около 300—500 нуклеотидов, что короче, чем 800—1000 нуклеотидов, достижимые методом обрыва цепи (например, метод Сэнгера). Такие ограничения могут затруднять секвенирование геномов, в частности, богатых повторенными последовательностями нуклеотидов. К 2007 году, пиросеквенирование обычно использовали для повторного секвенирования или секвенирования геномов, для которых известна последовательность нуклеотидов родственного вида.
СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ
В основе ДНК-секвенирования второго поколения лежат следующие два процесса: пространственно-разделенная полимеразная репликация отдельной молекулы ДНК на твердой матрице (микросфере или плоской подложке); циклическое химическое секвенирование. Каждая платформа отличается применяемым методом. Все платформы имеют одинаковые способы приготовления первичной ДНК библиотеки с помощью универсальных адаптеров. Эти олигонуклеотидные адаптеры комплиментарны ПЦР праймерам, используемым для амплификации библиотеки, и олигонуклеотидам, иммобилизованным на твердом носителе для клональной амплификации (Pettersson et al, 2008). Ключевыми особенностями для каждой коммерческой платформы являются последующие шаги.
Фрагменты ДНК лигируются (образование химической связи, с помощью фермента лигазы) с адаптерами и амплифицируются с помощью уникальной для каждой платформы технологии.Такие модифицированные молекулы ДНК амплифицируются на микросферах (454 и SOLiD) или на стеклянной подложке (Illumina). Далее амплифицированные нити ДНК спариваются с комплементарными ДНК нуклеотидами в циклических реакциях в индивидуальных проточных ячейках. В случае комплиментарности последовательности ДНК-матрицы возникает сигнал, который регистрируется системой детекции (Pettersson et al, 2009).
Технологии компаний Roche (454) и Life Technologies (SOLiD 5500 и Ion Torrent) используют эмульсионный ПЦР для синтеза клональных ДНК фрагментов на микросферах (Dressman et al, 2003). Водно-масляная эмульсия, микросферы и исследуемая ДНК смешиваются в прецизионной концентрации так, чтобы каждая микрокапля эмульсии содержала одну сферу и одну молекулу ДНК. После проведения ПЦР реакции, матрицы переносятся в пико-лунки („pico-wells“) или связываются со стеклянной проточной ячейкой (Margulies et al, 2005; McKernan et al, 2009). Illumina использует другую технологию: ДНК-кластеры создаются непосредственно в проточной ячейке с помощью так называемого „мостового ПЦР“ (bridge PCR) на стеклянной подложке (Bentley et al, 2008).
С практической стороны каждый метод обладает своими преимуществами и недостатками. Процесс эмульсионного ПЦР является сложным и трудоемким, хотя каждая из этих компаний разработала автоматизированные технологии, чтобы частично сократить трудозатраты по объему и времени. Генерация кластеров с помощью мостового ПЦР уже полностью автоматизирована. Приборы MiSeq фактически не нуждаются в участии человека в процессах от создания кластеров до анализирования данных, что является очень привлекательным с практической стороны применения. Потенциальным недостатком технологии мостового ПЦР Illumina является то, что успех генерации кластеров не известен до начала самого секвенирования. Это может приводить к дополнительным затратам в случае неудачной генерации кластеров. Но на практике процесс создания кластеров достаточно надежен, если ДНК-библиотеки имеют высокое качество, а концентрации точно выверены с помощью количественного ПЦР.
