В настоящее время появились и активно развиваются платформы ДНК-секвенирования "третьего поколения", представленные приборами: Helicos Heliscope (Helicos BioScience Corporation), PacBio RS SMRT (Pacific Biosciences) и MinION (Oxford Nanopore). Третье поколение отличается от второго тем, что первичная амплификация ДНК больше не требуется. Исследуемая ДНК секвенируется непосредственно на уровне одной молекулы с использованием специально созданных полимераз. Преимуществом этого подхода является то, что удается избежать проблем, связанных с накоплением ошибок, возникающих при амплификации ДНК. Однако, важно отметить, что ни одна из технологий третьего поколения пока не получила широкого распространения.
16. Эффективное секвенирование ПЦР-продуктов требует удаления дНТФ и праймеров из первой реакции, остающихся в избытке после ее завершения, что может быть осуществлено с помощью различных методов, основывающихся, главным образом, на заметной разнице в размерах дНТФ (менее 600 Да), олигонуклеотидных праймеров (в среднем - около 8000 Да и обычно не превышающих 12 000 Да) и самих продуктов ПЦР в виде двуцепочечных фрагментов ДНК, характеризующихся значительно большей молекулярной массой [Gyllensten, 1989]. Достаточно простым способом является осаждение ДНК, полученной в ходе ПЦР, в условиях неосаждения дНТФ и коротких фрагментов ДНК, каковыми являются праймеры. Сообщается об использовании для этой цели полиэтиленгликоля [Kusukawa et al., 1990], количественно осаждающего фрагменты ДНК крупнее 150 пн, тогда как более мелкие он осаждает плохо или совсем не осаждает [Paithankar, Prasad, 1991]. Аналогичное действие оказывает изопропанол. Применяется также ультрафильтрация с пороговыми величинами 30 000 Да [Nichols, Raben, 1994] или 100 000 Да [Krowzczynska, Henderson, 1992], ниже которых ингредиенты предыдущей реакции удаляются. Этот же принцип ультрафильтрации лежит в основе спин-диализа в микроцентрифуге с помощью специальных микроконцентраторов Centricon 30 фирмы "Amicon" (США), продемонстрировавшего эффективное удаление оставшихся в ходе ПЦР дНТФ и олигонуклеотидных праймеров, что позволило провести успешное секвенирование полученного продукта [Gal, Hohn, 1990; Wong et al., 1987].
Следует отметить описанную возможность ферментативного удаления неиспользованного количества праймеров после завершения первой стадии ПЦР с помощью экзонуклеазы VII [Li et al., 1991]. Экзонуклеаза VII проявляет свою активность по отношению к одноцепочечным фрагментам ДНК, начиная одновременный гидролиз как с 5'-, так и с 3'-концов, не оказывая при этом заметного действия на двуцепочечные продукты амплификации. Был предложен и другой подход, требующий, как и при осаждении фрагментов ДНК, только одну пробирку и заключающийся в ферментативном разрушении с помощью экзонуклеазы I и щелочной фосфатазы краба неиспользованных дНТФ и праймеров [Werle et al., 1994]. Метод относительно прост и исключает потерю ДНК во время многочисленных процедур, применяемых при очистке ПЦР-продуктов более сложными методами, описанными ниже.
Как уже отмечалось выше, в ходе ПЦР случается, что образуется смесь гетерогенных молекул ДНК, и тогда простое осаждение или ферментативная обработка, хотя и исключат из дальнейшего этапа секвенирования мешающие дНТФ и праймеры из первой реакции, однако не решат проблему наличия посторонних ДНК. В этой связи было предложено проводить очистку амплификатов с помощью электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях или хроматографией, что одновременно удаляло непрореагировавшие дНТФ и праймеры, а также позволяло в дальнейшем проводить секвенирование именно того фрагмента ДНК, который и был намечен. После проведения электрофоретического разделения дальнейшие процедуры по очистке нужных фрагментов ДНК из геля могут быть практически любыми, начиная от простого замораживания/оттаивания до электроэлюции [Маниатис и др., 1984; Sambrook et al, 1989; Cao, Brosius, 1993]. Описанные в литературе способы выделения фрагментов ДНК из геля, позволяющие осуществить дальнейшее эффективное секвенирование, состоят в их элюции на ДЭАЭ-бумагу [Nickrent, 1994], в разрушении агарозы под действием агаразы [Gold, 1992] или сорбции биотинилированной ДНК (за счет одного из праймеров, несущего биотин) из расплава геля на магнитных частицах со стрептавидином [Green et al., 1990]. Использование других магнитных частиц, покрытых карбоксилом, способных в присутствии полиэтиленгликоля и NaCl обратимо сорбировать ДНК, уже не требовало наличия биотиновой метки [DeAngelis et al., 1995]. Сообщается также о разделении продуктов амплификации в легкоплавкой ага-розе и использовании в дальнейшем секвенировании с помощью секвеназы данного ПЦР-продукта прямо вместе с расплавленным кусочком легкоплавкой агарозы, не прибегая к элюции, что, впрочем, не позволило на этапе мечения снижать температуру инкубации ниже 37° С, во избежание образования при этом в реакционной смеси геля [Kretz et al., 1989; Kretz et al., 1990].
Был предложен интересный подход к элюции ПЦР-фрагмента ДНК из полиакриламидного геля, заключающийся в предварительном высушивании геля, окрашенного бромистым этидием, и с наложенным на него кусочком фильтровальной бумаги, вырезанному по размеру полосы ДНК [Wu et al., 1996]. Далее, поскольку размер фильтровальной бумаги строго соответствовал размеру исследуемой полоски ДНК, то вырезался кусочек сухого полиакриламидного геля, исходя из контуров бумаги. После прогрева в течение 15 мин в микроцентрифужной пробирке этого кусочка геля вместе с бумагой, последняя удалялась центрифугированием. Есть работы, в которых элюция из полиакриламидного геля продукта ПЦР для его последующего секвенирования осуществлялась простой диффузией в солевой раствор в течение ночи [Huber, McMahon, 1988]. Недавно было сообщено об использовании специального небулай-зера (Gel Nebulizer) (Millipore, США) для выделения ПЦР-продукта из агарозного геля, пригодного для последующего его секвенирования [Leonard et al., 1998]. Это устройство представляет собой своеобразную колонку с соплом, рассчитанную на центрифугирование в микроцентрифуге при 10 000g, и предназначено для элюции ДНК из образующихся в этом процессе мельчайших кусочков агарозного или полиакриламидного гелей. Причем данная процедура требует всего около 10 мин. Также весьма быстрая очистка ПЦР-продуктов, завершаемая всего за 7-20 мин, возможна с помощью хроматографии высокого давления [Katz, Dong, 1990; Kalnoski et al., Warren, Doninger, 1991], что, однако, требует наличия специального дорогостоящего оборудования.
17. Принцип создания генно-инженерных вакцин заключается в том, что интересующий нас ген (ответственный за синтез иммунного белка вируса) «вырезают» из ДНК вируса с помощью ферментов (рестриктаз) и встраивают, используя ферменты (лигазы), в ДНК вектора (например, в плазмиду Е. coli — это автономная кольцевая ДНК из 4—6 тыс. пар нуклеотидов, способная размножаться в клетках Е. сой). Затем эту рекомбинантную ДНК вводят в клетки Е. coli, в которых рекомбинантная ДНК размножается (реплицируется) и происходит экспрессия встроенного гена, т. е. синтез соответствующего белка (кодируемого встроенным геном вируса).
Бактериальные клетки Е. coli культивируют в питательной среде, и происходит «наработка» иммуногенного белка вируса, который выделяют и после соответствующей очистки используют в качестве материала для вакцины. Однако необходимо отметить, что многие вирусные белки, успешно синтезированные в микроорганизмах, имеют очень низкую иммуногенную активность. Причина этого в особенностях формирования структуры вирусных белков. Как правило, они гликозилированы, имеют сложную третичную или четвертичную структуру. Так, гемагглютинин вируса гриппа находится в вирионе в виде тримера, который образуется из мономерных полипепдидов в клетках животных. Получить in vitro такую функционально активную структуру гемагглютинина не удается. Иммуногенность гемагглютинина в вирионе в несколько тысяч раз выше, чем мономерного полипептида, синтезированного в бактериях.
При получении генно-инженерных вакцин в качестве векторов кроме плазмид используют фаги, дрожжи, вирусы животных (вирус осповакцины, аденовирусы, бакуло — и герпесвирусы).
Наибольший эффект получен с вирусом осповакцины, используемым в качестве вектора. Этот вирус имеет большой геном (около 187 тыс. пар нуклеотидов). Из него можно удалить значительный участок (около 30 тыс. пар нуклеотидов), который не является жизненно необходимым для репродукции этого вируса в клетках, а на его место встроить чужеродные гены тех вирусов, против которых получают вакцину. Полученные при этом рекомбинантные ДНК способны размножаться в организме привитых и индуцировать образование иммунитета не только против оспы, но и против того вируса, чей ген встроен в его геном. Использование вируса осповакцины в качестве вектора для вакцинации имеет ряд преимуществ: способность размножаться в клетках животных многих видов; экспрессировать несколько генов; индуцировать гуморальный и клеточный иммунитеты; термостабильность; экономичное производство и легкость применения. Выявленные ранее недостатки у вируса осповакцины, связанные с реактогенностью, были в основном устранены с помощью генетических манипуляций. Возможность включения нескольких генов, кодирующих соответствующие иммуногены, дают возможность вакцинировать животных одновременно против нескольких вирусных болезней. Однако необходимо иметь в виду, что индивидуумы, уже иммунные к вирусу осповакцины, при вакцинации рекомбинантным вирусам не дают эффекта ввиду отсутствия его приживаемости.
В последние годы получены профилактические препараты из рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего гены, кодирующие поверхностные гликопротеиды вирусов гриппа, бешенства, респираторно-сицитиального, болезни Ауески, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и др.
Суть метода ПЦР
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR – polymerase chain reaction) – метод получения множества копий определенных фрагментов ДНК (генов) в биологическом образце.
Сущность ПЦР как метода молекулярной биологии заключается в многократном избирательном копировании определённого гена (участка ДНК) при помощи специальных ферментов в условиях in vitro. Важной особенностью ПЦР является получение копий конкретного участка ДНК (гена), соответствующего заданным условиям. Синонимом процесса копирования ДНК является «амплификация». Репликация ДНК in vivo также может считаться амплификацией. Однако в отличие от репликации, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются короткие участки ДНК (максимум 40 000 пар нуклеотидов).
Основные принципы
Итак, ПЦР - это многократное копирование определенных фрагментов ДНК in vitro в процессе повторяющихся температурных циклов. Как же протекает процесс реакции в пределах одного температурного цикла?
Образование нуклеотидной цепи осуществляется ферментом ДНК-полимеразой. Однако для начала работы ферменту необходима стартовая площадка. В качестве площадок выступают "праймеры" (затравки) - синтетические олигонуклеотиды длиной 15-20 нуклеотидов. Праймеров должно быть два (прямой и обратный), они комплементарны участкам ДНК-матрицы и именно фрагмент ДНК, ограниченный праймерами, будет многократно копироваться ДНК-полимеразой. Работа полимеразы заключается в последовательном добавлении нуклеотидов, комплементарных последовательности ДНК-матрицы. Тем самым в одном температурном цикле вновь синтезируется два новых фрагмента ДНК (т.к. молекула ДНК - двуцепочечная, то и матриц изначально две). Таким образом, за 25-35 циклов в пробирке накапливаются миллиарды копий участка ДНК, определенного праймерами. Структуру отдельного цикла можно представить следующим образом:
· денатурация ДНК (плавление, расхождение цепей ДНК) - 95°С - 1 или 2 минуты;
· отжиг праймеров (затравки связываются с ДНК-матрицей, температура данной стадии
· определяется нуклеотидным составом праймера) - 60°С (к примеру) - 1 минута;
