При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики данного метода КРИТИЧЕСКИЕ КОМПОНЕНТЫ ПЦР При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики данного метода важны для исследователя: • ли, других продуктов от ПЦР быть не должно (при этом не обращают внимание на оСпецифичность реакции – продуктом ПЦР должен быть именно тот локус ДНК, который амплифицировашибочно включенные, в результате работы полимеразы, нуклеотиды); • Точность синтеза ДНК – ошибки в амплификафии недопустимы при определении первичной структуры аплифицированного локуса, или при использвоании продукта ПЦР для синтеза кодируемого им белка в генно-инженерных системах экпресии; • Эффективность синтеза ДНК – количественно оценивается по выходу продукта после окончании реакции. Теоретически через n циклов количество продуктов ПРЦ достигнет 2 n-1 штук с каждой молекулы к. ДНК. Однако на практике такое происходит редко.
19. Метод ПЦР был предложен в 1983 г. американским исследователем Кари Муллисом. Суть этого метода заключается в специфической амплификации ДНК с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух праймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДНК, и ориентированы З'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать. Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. Используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность, можно увеличить количество копий изучаемого фрагмента ДНК в сотни миллионов раз. Такое увеличение, позволяющее визуализировать заданный фрагмент ДНК на электрофореграмме, а также использовать продукт амплификации для дальнейшего изучения с помощью других методов, можно считать главным достоинством метода ПЦР. Основной недостаток этого метода - необходимость знания ДНК-последовательностей, фланкирующих изучаемый ген, для создания праймеров.
Для проведения специфической амплификации необходимы:
Компоненты реакции
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
· Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
· Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq -полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu -полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo -полимераза), Thermus thermophilus (Tth -полимераза) и другие.
· Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Праймеры
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.
После гибридизации матрицы с праймером (отжиг[11]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).
Важнейшая характеристика праймеров — температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица. В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80 °C.
При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:
· GC-состав ~ 40—60 %;
· близкие Tm праймеров (отличия не более, чем на 5 °C);
· отсутствие неспецифических вторичных структур — шпилек[13] и димеров[14];
· желательно, чтобы на 3’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной
Ход реакции
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20—35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий.
Денатурация
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется плавлением (денатурацией), так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Обычно, перед первым циклом проводят длительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин для полной денатурации матрицы и праймеров.
Отжиг
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 5 градусов меньше, чем температура плавления праймеров. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре). Время стадии отжига — 30 сек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов. Поэтому рекомендуется подбирать праймеры с температурой плавления выше 60 °C и проводить отжиг и элонгацию одновременно, при 60—72 °C.
Элонгация
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7—10 мин.
Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n — 2n, где n — число циклов реакции[15]. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100 %, поэтому в действительности P ~ (1+E)n, где P — количество продукта, Е — средняя эффективность цикла.
Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.
Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато».
20. ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:
- приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;
- выделения ДНК/РНК;
- приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;
- детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.
В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: архив (для учетных документов), комнату для персонала, кабинет заведующего, раздевалки для сотрудников, комнаты приема пищи, санитарных комнат (туалет), подсобных помещений (склад).
Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами). В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием материала, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и прочее), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (иммунология, например), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.
Зону выделения ДНК/РНК размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей лаборатории допускается выделение ДНК/РНК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения ДНК/РНК, в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе для выделения ДНК/РНК не допускается проведение других видов работ!
В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК/РНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.
При необходимости этап выделения ДНК/РНК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов - для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения ДНК/РНК.
Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом. При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.
Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.
ПЦР-лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением. Все помещения ПЦР-лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.
При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. При необходимости в ПЦР-лаборатории могут быть установлены кондиционеры.
Внутреннюю отделку помещений выполняют в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности стен, пола и потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываемыми, устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств. Полы не должны быть скользкими. Лабораторная мебель должна иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств. Поверхность столов не должна иметь трещин и швов. Помещения лаборатории должны быть непроницаемы для грызунов и насекомых. ПЦР-лабораторию обеспечивают средствами пожаротушения.Помещения на всех этапах ПЦР-анализа оборудуют бактерицидными лампами.
Существует ряд модификаций ПЦР, используемых в зависимости от конкретных целей проведения реакции или от метода последующего молекулярного анализа амплификатов. Одна из широко используемых модификаций ПЦР - метод мультиплексной амплификации (МПА), позволяющий проводить ПЦР нескольких изучаемых фрагментов в одной пробирке, что не только убыстряет и удешевляет анализ, но и позволяет рассматривать одни фрагменты, получающиеся в результате МПА, в качестве положительного контроля реакции для других. Добавляя в реакционную смесь меченые dNTP, можно при необходимости получать меченые продукты ПЦР, Проведение ПЦР с молекулами кДНК позволяет анализировать экспрессию генов и получать большие количества кДНК. Реакцию амплификации можно проводить непосредственно на хромосомных препаратах и при использовании меченых нуклеотидов визуализировать комплементарные продуктам амплификации участки ДНК на хромосомах, (метод PRINS - от англ. polymerase reaction in situ). Существуют варианты ПЦР (ассиметричная ПЦР - с избытком одного из олигопраймеров; ПЦР с использованием магнитных частиц с фиксированным на их поверхности стрептавидином и биотиновой метки одного из праймеров), позволяющие синтезировать и выделять преимущественно однопепочечные фрагменты ДНК, что значительно облегчает их секвенирование. В ряде случаев применяют метод GAWTS - амплификацию с праймерами, несущими сайт узнавания для фермента Т7-РНК-полимеразы, с последующим секвенированием одноцепочечного РНК-транскрипта, полученного из амплификата при помощи Т7-РНК-полимеразы.
ПЦР длинных фрагментов — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований). Используют смесь двух полимераз, одна из которых — Taq -полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью, обычно это Pfu полимераза. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой, так как Taq -полимераза останавливает синтез ДНК если был добавлен не комплементарный нуклеотид. Этот не комплементарный нуклеотид удаляет Pfu полимераза. Смесь полимераз берется в отношении 50:1 или даже меньше 100:1, где Taq -полимеразы берётся в 25—100 раз больше по отношению к Pfu -полимеразе.
Количественная или ПЦР в реальном времени — используется для непосредственного наблюдения за измерением количества конкретного ПЦР продукта в каждом цикле реакции. В этом методе используют флуоресцентно-меченые праймеры или ДНК-зонды для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления; или используется флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I (но лучше использовать SYTO 13), который связывается с двухцепочечной ДНК. Sybr Green I обеспечивает простой и экономичный вариант для детекции и количественного определения ПЦР-продуктов в ходе ПЦР в режиме реального времени без необходимости использования специфичных флуоресцентных зондов или праймеров. В ходе амплификации краситель SYBR Green I встраивается в малую бороздку ДНК ПЦР продуктов и испускает более сильный по сравнению с несвязанным красителем флуоресцентный сигнал при облучении синим лазером. SYBR Green I совместим со всеми известными на сегодняшний день приборами для проведения ПЦР в режиме реального времени. Максимум поглощения для SYBR Green I находится при длине волны 494 нм. Кроме главного, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения — при 290 нм и 380 нм. Максимум испускания для SYBR Green I находится при длине волны 521 нм (зелёный)
21. ПЦР в реальном времени. На сегодня существует метод, лишенный вышеперечисленных недостатков - это метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) [4]. Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество.Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции.
Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопление ампликонов, на каждом цикле амплификации.
