Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


≈лектрофоретичн≥ методи анал≥зу




≈лектрофорезом називаЇтьс€ рух зар€джених колоњдних частинок чи молекул високомолекул€рних сполук п≥д д≥Їю зовн≥шнього електричного пол€. ÷ей метод дозвол€Ї розд≥лити молекули, що р≥зн€тьс€ м≥ж собою за величиною ≥ знаком зар€ду високомолекул€рних сполук, а також зол≥ колоњдних систем з метою ≥дентиф≥кац≥њ ≥ к≥льк≥сного њх визначенн€, а також дл€ встановленн€ њх молекул€рноњ маси та структури.

≈лектричн≥ зар€ди молекул високомолекул€рних сполук виникають в результат≥ дисоц≥ац≥њ чи протонизац≥њ йоногенних груп. “ак, зар€д молекул б≥лк≥в €вл€Ї собою сумарний зар€д дисоц≥йованих карбоксильних груп та протонованих ам≥ногруп ам≥нокислот Ц структурних одиниць б≥лк≥в. ÷ей загальний зар€д може бути позитивний чи негативний. Ѕ≥льш≥сть б≥лк≥в мають у нейтральному розчин≥ негативний зар€д. «ар€д колоњдних частинок обумовлюЇтьс€ адсорбц≥Їю потенц≥алвизначальних йон≥в на поверхн≥ €дра. ™ колоњди, частинки €ких мають позитивний зар€д, а ≥нш≥ Ц негативний.

¬еличина ≥ знак зар€ду молекул високомолекул€рних речовин ≥ колоњдних частинок залежить в≥д рЌ середовища.

ѕри пропусканн≥ кр≥зь буферний розчин пост≥йного електричного струму м≥ж катодом ≥ анодом створюЇтьс€ град≥Їнт електричноњ напруги. «ар€джен≥ частинки починають рухатис€ в електричному пол≥ до в≥дпов≥дного електрода.

≤нтенсивн≥сть руху частинок визначаЇтьс€ добутком напруженост≥ електричного пол€ (≈) ≥ сумарного зар€ду частинки (Q), €кому протистоњть сила вТ€зкост≥ (Fв), що дор≥внюЇ Fв=6πηrv (η-коеф≥ц≥Їнт вТ€зкост≥, r-рад≥ус частинки, v-швидк≥сть руху). ¬ стац≥онарному стан≥ E∙Q=6πηrv, питома рухлив≥сть U=V/E=Q/6πηrv.

«алежно в≥д величини зар€ду молекули ¬ћ— чи частинки колоњду, њх розм≥р≥в, вони мають р≥зну швидк≥сть руху, ≥ це дозвол€Ї розд≥лити сум≥ш досл≥джуваних речовин на зони однакових частинок, €к≥ в електричному пол≥ рухаютьс€ з однаковою швидк≥стю.

V=R∙E, де: R-коеф≥ц≥Їнт пропорц≥йност≥, €кий називаЇтьс€ електрофоретичною рухлив≥стю ≥ чисельно дор≥внюЇ швидкост≥ руху частинки при ≈=1¬/см.

якщо припинити д≥ю електричного пол€ до того, €к йони сум≥ш≥, що досл≥джуЇтьс€, дос€гнуть електрод≥в, компоненти ц≥Їњ сум≥ш≥ розпод≥л€тьс€ в≥дпов≥дно до њхньоњ електрофоретичноњ рухливост≥.

≈лектрофоретична рухлив≥сть зростаЇ ≥з зб≥льшенн€м зар€ду частинки, величина €кого залежить в≥д рЌ середовища. „им б≥льш≥ за розм≥рами (молекул€рними масами) молекули ¬ћ— чи частинки колоњдних систем, тим менша њх електрофоретична рухлив≥сть. ÷е повТ€зано ≥з зростанн€м сил терт€ та електростатичноњ взаЇмод≥њ м≥ж частинками менших розм≥р≥в. Ќа рухлив≥сть частинок також впливаЇ њх форма. ћолекули однакових розм≥р≥в, однаковоњ величини зар€ду, але р≥зноњ форми рухаютьс€ в процес≥ електрофорезу з р≥зною швидк≥стю.

ѕараметри електричного пол€ Ц напруга, сила струму, оп≥р Ц також впливають на рухлив≥сть молекул ¬ћ— та колоњдних частинок.

ѕри проведенн≥ електрофорезу сила струму повинна бути пост≥йною в даному конкретному випадку розд≥ленн€ речовин, так €к це забезпечуЇ в≥дтворюван≥сть результат≥в. ѕри р≥зних значенн€х сили струму положенн€ зон розд≥лених речовин буде р≥зним. ƒовжина шл€ху, пройденого зар€дженими частинками в електричному пол≥ при пост≥йному значенн≥ сили струму буде залежати в≥д часу проходженн€ струму.

≈лектрофоретична рухлив≥сть пропорц≥йна прикладен≥й напруз≥ або град≥Їнту напруги, що вим≥рюЇтьс€ у ¬/см. ≈лектрофорез буваЇ низьковольтний (≈=100-500¬) та високовольтний (≈=500-10000¬) з град≥Їнтами напруги в≥д 20 до 200 ¬/см.

≈лектричний оп≥р залежить в≥д йонноњ сили буферного розчину, в €кому в≥дбуваЇтьс€ розд≥ленн€ речовин, к≥лькост≥ зар€джених частинок, що розд≥л€ютьс€, типу та розм≥р≥в нос≥€.

” процес≥ електрофорезу вид≥л€Їтьс€ тепло, к≥льк≥сть €кого визначаЇтьс€ добутком квадрату сили струму на оп≥р. ѕри пост≥йн≥й напруз≥ буде зб≥льшуватис€ електричний струм, €кщо електричний оп≥р буде зменшуватис€.:

,

що призведе до п≥двищенн€ температури ≥ випаровуванн€ буфера, а також до взаЇмод≥њ м≥ж частинками, що розд≥л€ютьс€. ƒл€ в≥дведенн€ тепла при електрофорез≥ апарати обладнуютьс€ системою охолодженн€. „асто дл€ охолодженн€ використовують циркулюючу охолоджену воду.

Ќа електрофоретичну рухлив≥сть впливаЇ характер буферу. ƒл€ ефективного в≥дведенн€ тепла доц≥льно застосовувати буфер з низькою електропров≥дн≥стю, хоча при цьому знижуЇтьс€ швидк≥сть м≥грац≥њ частинок в електричному пол≥.

«азвичай, використовують буфери з йонною силою, €ка лежить в межах концентрац≥њ 0,05-0,15 моль/дм3. ÷е даЇ можлив≥сть вибрати оптимальн≥ значенн€ напруги ≥ сили струму, щоб при цьому нагр≥в системи не був критичним. Ќайпоширен≥ш≥ форм≥атний, ацетат≠ний, цитратний, фосфатний, трис-буфер та ≈ƒ“ј-буфер.

Ѕуфери, €к≥ наливають у дв≥ камери, в €ких розм≥щен≥ електроди, €к правило, так≥ ж, €к≥ використовують дл€ просоченн€ нос≥€.

як нос≥њ, в порах €ких в≥дбуваЇтьс€ електрофорез, використо≠вують однор≥дн≥ ≥ в≥дносно ≥нертн≥ речовини, €к≥ просочуютьс€ в≥дпов≥дним буфером. Ќедол≥ком нос≥њв Ї те, що вони про€вл€ють адсорбц≥йну активн≥сть ≥ тим самим стримують перем≥щенн€ зразка в електричному пол≥. ÷е призводить до розмиванн€ зон на електрофореграмах, внасл≥док чого зразок рухаЇтьс€ не у вигл€д≥ компактноњ смуги, а маЇ видовжену форму Ц з Ђхвостомї, що зменшуЇ ч≥тк≥сть розд≥ленн€.

Ќегативно впливаЇ на процес розд≥ленн€ речовин ≥ електроосмос, обумовлений виникненн€м в≥дносного електричного зар€ду м≥ж молекулами води буферного розчину ≥ поверхнею нос≥€. ¬насл≥док цього йони г≥дроксон≥ю з води захоплюють нейтральн≥ речовини. ќтримавши позитивний зар€д йона Ќ3ќ+, ц≥ речовини починають рухатись до катода, а швидк≥сть руху ан≥он≥в при цьому знижуЇтьс€. Ќеобх≥дно вживати заход≥в дл€ того, щоб пот≥к р≥дини не вин≥с досл≥джуван≥ речовини за меж≥ нос≥€.  р≥м того, електроосмос спричин€Ї розширенн€ зон, а це пог≥ршуЇ розд≥ленн€ речовин.

якщо в €кост≥ нос≥њв використовуютьс€ гел≥, то в таких нос≥€х негативний вплив на перем≥щенн€ досл≥джуваних речовин при електрофорез≥ маЇ ефект молекул€рного сита нос≥€. √ел≥ мають пори р≥зного розм≥ру, через €к≥ можуть проскакувати частинки досл≥джуваних речовин т≥льки певних розм≥р≥в. “ак, у крохмальному, агаровому, пол≥акрилам≥дному гел≥ молекули великого розм≥ру рухаютьс€ кр≥зь гель тим пов≥льн≥ше, чим менш≥ розм≥ри пор. ” такому випадку накладаютьс€ €к ефект електрофорезу, так ≥ ефект прос≥юванн€ частинок через молекул€рне сито.

ѕрилади дл€ електрофорезу складаютьс€ з джерел пост≥йного струму та електрофоретичного блоку.

¬≥д джерела живленн€, що маЇ систему стаб≥л≥зац≥њ напруги ≥ си≠ли струму, високостаб≥льний пост≥йний струм надходить до електро≠форетичного блока. ≈лектрофоретичний блок складаЇтьс€ з електро≠д≥в, герметичноњ камери ≥з орган≥чного скла, буферних камер, а також ≥нших пристроњв у залежност≥ в≥д типу електрофоретичного блоку.

якщо досл≥джуван≥ речовини безбарвн≥, то дл€ визначенн€ њх положенн€ на електрофореграм≥ њх необх≥дно фарбувати. ™ багато р≥зних барвник≥в дл€ конкретних речовин. “ак, б≥лки можна фарбувати бромфеноловим син≥м з оцтовою кислотою, ам≥дочорним ¬, дансилхлоридом ≥ ≥н., пол≥сахариди можна ви€вл€ти за реакц≥Їю з йодом, л≥попротењни Ц суданом чорним в етанол≥ та ≥н.

ƒл€ к≥льк≥сного визначенн€ фракц≥њ њњ п≥сл€ забарвленн€ зми≠вають з електрофореграми в≥дпов≥дним розчинником ≥ визначають оптичну густину екстракту спектрофотометричним чи фотоколори≠мет≠ричним методом. ≤нколи застосовують скануванн€ електрофоре≠грами за допомогою денситометра. ÷ей прилад дозвол€Ї вим≥рювати ≥нтенсивн≥сть св≥тла, €ке пройшло кр≥зь смужку нос≥€. ≤нтенсивн≥сть цього св≥тла звТ€зана оберненою залежн≥стю з к≥льк≥стю забарвленоњ речовини у дан≥й фракц≥њ на електрофореграм≥. ѕрилад кал≥брують з використанн€м таких електрофореграм, €к≥ м≥ст€ть в≥дому к≥льк≥сть досл≥джуваноњ речовини, нанесеноњ на нос≥й ≥ обробленоњ барвником.

«алежно в≥д розм≥р≥в частинок, а також завдань њх розд≥ленн€, електром≥грац≥ю под≥л€ють на безпосередньо електрофорез Ц розд≥≠лен≠н€ молекул ¬ћ— та колоњдних частинок; ≥онофорез Ц перем≥щенн€ в електричному пол≥ низькомолекул€рних сполук через б≥олог≥чн≥ мембрани (введенн€ л≥карських препарат≥в у йонному стан≥ кр≥зь шк≥ру та слизов≥ оболонки); електрод≥ал≥з Ц в≥дд≥ленн€ високо≠молекул€рних сполук в≥д низькомолекул€рних; електроосмос Ц рух йон≥в кр≥зь нап≥впроникну перетинку п≥д впливом електричного пол€.

ѕрепаративний електрофорез застосовують дл€ вид≥ленн€ значноњ к≥лькост≥ препарату дл€ подальшого його застосуванн€. јнал≥тичний електрофорез застосовують дл€ визначенн€ компонент≥в у сум≥ш≥, контролю чистоти речовини та ≥н. «а способом розм≥щенн€ нос≥њв розр≥зн€ють горизонтальний та вертикальний електрофорез.

«алежно в≥д мети досл≥джень найчаст≥ше застосовують фронтальний електрофорез (або метод рухомоњ меж≥), зональний електрофорез (або електрофорез на нос≥њ), ≥зоелектрофокусуванн€, ≥зотахофорез, ≥муноелектрофорез.

 ожний з цих метод≥в маЇ р€д модиф≥кац≥й, €к≥ в де€ких випадках набувають певноњ самост≥йност≥. ќсновн≥ з них: електрофорез у град≥Їнт≥ густини, в колонках, в блоц≥ ≥ неперервний (проточний), диск-електрофорез, на нос≥€х Цпапер≥, ацетат целюлоз≥, в тонких шарах, гел€х та ≥н.

‘ронтальний електрофорез (метод рухомоњ меж≥) пол€гаЇ в тому, що речовини, €к≥ досл≥джуютьс€, знаход€тьс€ в усьому обТЇм≥ буферного розчину, у €кий занурен≥ електроди. –озташуванн€ досл≥джуваноњ речовини у м≥желектродному простор≥ в певний час електрофорезу визначають оптичним методом. ¬изначають у час≥ розташуванн€ меж≥ €ка в≥дд≥л€Ї речовину в≥д розчинника, тобто визначають швидк≥сть руху меж≥.

Ѕ≥льш широко використовуЇтьс€ зональний електрофорез Ц електрофорез на нос≥њ Ц завд€ки висок≥й розд≥льн≥й здатност≥, велик≥й швидкост≥, можливост≥ розд≥ленн€ €к частинок колоњдних систем ≥ молекул високомолекул€рних сполук, так ≥ неорган≥чних сполук. —уть методу пол€гаЇ в тому, що процес електрофорезу в≥дбуваЇтьс€ на поверхн≥ та в порах твердого нос≥€. ћатер≥ал нос≥€ повинен мати однор≥дн≥ пори, бути механ≥чно ст≥йким, х≥м≥чно ≥нертним по в≥дношенню до буфера та компонент≥в сум≥ш≥, що розд≥л€Їтьс€, мати незначну адсорбц≥йну та електроосмотичну здатн≥сть.

¬икористанн€ нос≥њв у зональному електрофорез≥ дуже поширене, але не обовТ€зкове. ≤снуЇ електрофорез ≥з стаб≥л≥зац≥Їю зон на певн≥й модиф≥кац≥њ проточного електрофорезу, де нос≥њ не використовуютьс€.

јдсорбц≥€ речовин, що рухаютьс€ в електричному пол≥, на нос≥њ призводить до упов≥льненн€ њх руху ≥ утворенн€ Ђхвост≥вї в електро≠форетичних зонах, що ускладнюЇ розд≥ленн€ ≥ к≥льк≥сний анал≥з.

¬изначити адсорбц≥йну здатн≥сть нос≥€ можна попередньо пров≥вши хроматограф≥чне досл≥дженн€ повед≥нки даноњ речовини на нос≥њ без впливу електричного пол€ ≥ встановити к≥льк≥сть речовини, €ка утримуЇтьс€ на нос≥њ.

як вже зазначалось, ≥снуЇ багато р≥зновидностей нос≥њв: хрома≠тограф≥чний пап≥р, пл≥вки ацетат целюлози, тонк≥ шари целюлози, порошки SiO2 та Al2O3, крохмальн≥, агарозн≥, пол≥акрилам≥дн≥ ≥ ≥нш≥ гел≥.

як нос≥й дл€ електрофорезу найпрост≥шим Ї хроматограф≥чний пап≥р, але в≥н маЇ дуже незначну розд≥льну здатн≥сть у пор≥вн€нн≥ з гел€ми.

јцетат целюлоза маЇ незначну адсорбц≥йну здатн≥сть, що даЇ можлив≥сть розд≥л€ти нав≥ть дуже незначн≥ к≥лькост≥ речовин. ÷ей нос≥й менш г≥дроф≥льний, н≥ж пап≥р, тому в≥н утримуЇ меншу к≥льк≥сть буфера. Ќа цьому нос≥њ розд≥ленн€ речовин в≥дбуваЇтьс€ швидко.

“онк≥ шари целюлози, оксид≥в —ил≥ц≥ю, јлюм≥н≥ю та ≥нш≥ нанос€ть на скл€н≥ пластинки ≥ просочують буфером. Ќайб≥льш високе розд≥ленн€ речовин дос€гаЇтьс€ при застосуванн≥ у €кост≥ нос≥њв гел≥в. ѕри гель-електрофорез≥ Ї незначними адсорбц≥€, електроосмос та розмиванн€ електрофоретичних зон в результат≥ дифуз≥њ. √ель-електрофорез, зазвичай, провод€ть з анал≥тичною, а не препаративною метою.

 рохмальн≥ гел≥ готують при нагр≥ванн≥ й охолодженн≥ частково г≥дрол≥зованого крохмалю з буфером. ¬исокопорист≥ гел≥ утворюютьс€ при додаванн≥ до буфера менше 2% крохмалю, а низькопорист≥ Ц в≥д 8 до 15%. ” б≥льшост≥ випадк≥в крохмальн≥ гел≥ нанос€ть на пластинки з пол≥метилметакрилату дл€ горизонтального чи вертикального електрофорезу.

јгароза Ц пол≥сахарид, що м≥стить залишки β-D-галактоп≥ранози та 3,6-анг≥дридо-α-галактоп≥ранози. √ел≥ утворюютьс€ при вм≥ст≥ агарози в буфер≥ б≥льше 0,3%. «вичайно використовують 2% гел≥ дл€ електрофорезу, а з вищим вм≥стом Ц дл€ гель-ф≥льтрац≥њ (€к молекул€рне сито).

јгар Ц сум≥ш галактозних пол≥мер≥в агарози ≥ агаропектину. ¬м≥ст цих пол≥мер≥в у гел≥ становить 1%. јгаров≥ гел≥ м≥ст€ть велику к≥льк≥сть води.

ѕол≥акрилам≥дн≥ гел≥ Ї найб≥льш розповсюдженими завд€ки дуже добрим характеристикам:

І розм≥ри пор у цих гел€х можна зм≥нювати в широких межах;

І њх можна використовувати з р≥зноман≥тними буферами;

І вони мають дуже низьку адсорбц≥йну здатн≥сть ≥ електроосмос;

І на цих гел€х розпод≥л досл≥джуваних речовин в≥дбуваЇтьс€ швидко з високим розд≥ленн€м.

ѕол≥акрилам≥дн≥ гел≥ отримують при пол≥меризац≥њ акрилам≥ду з N,N,N',N'-тетраметилендиам≥ном та N,N'-метилен-б≥с-акрилам≥дом у присутност≥ катал≥затора (NH4)2SO5 (0,1-0,3%). ѕол≥акрилам≥дн≥ гел≥ готують ≥з загальним вм≥стом акрилам≥ду в≥д 3% (пори мають д≥аметр 0,5 нм) до 30% (пори Ц 0,2 нм.).

≈лектрофорез у пол≥акрилам≥дному гел≥ провод€ть у колонках (вертикальних трубочках) або на пластинках.

–ис. 10.  амера електрофоретична.

1-стакан; 2-верхн€ камера; 3-кришка;4-трубка;5-стержень; 6-диск; 7-втулка;
8-зм≥йовик.

√ель, що застосовуЇтьс€ дл€ електрофорезу, пол≥меризуЇтьс€ безпосередньо в скл€них трубках, €к≥ знизу закриваютьс€ гумовими втулками ≥ встановлюютьс€ у спец≥альному штатив≥. √отовий стовпчик гелю маЇ два шари: нижн≥й Ц др≥бнопористий дл€ розд≥ленн€ сум≥ш≥ на фракц≥њ, верхн≥й Ц крупнопористий дл€ звуженн€ зони сум≥ш≥ перед фракц≥онуванн€м. —кл€н≥ трубочки в прилад≥ дл€ вертикального гель-електрофорезу, €к правило, мають довжину 10см ≥ д≥аметр 6-8мм. –озчин досл≥джуваноњ сум≥ш≥ речовин нанос€ть на поверхню стовпчика гелю або зразок включають у крупнопористу частину гелю при його пол≥меризац≥њ.

ѕеревагами пол≥акрилам≥дного гель-електрофрезу Ї те, що можна вар≥ювати концентрац≥ю складових частин гелю системою буфер≥в та њх складом, концентрац≥Їю досл≥джуваних речовин, рЌ системи, електричними параметрами процесу та ≥н.

як вже зазначалось, розд≥льна здатн≥сть гель-електрофорезу в пол≥акрилам≥дному гел≥ дуже велика. якщо, наприклад, у раз≥ електрофорезу на папер≥ б≥лк≥в сироватки кров≥ ви€вл€Їтьс€ пТ€ть зон, то електрофорез цього зразка в пол≥акрилам≥дному гел≥ даЇ б≥льше 20 фракц≥й б≥лк≥в, а к≥льк≥сть досл≥джуваноњ проби при цьому треба в 20 раз≥в менше, н≥ж дл€ електрофорезу на папер≥.

ѕол≥акрилам≥дний гель Ї нос≥Їм у диск-електрофорез≥. ¬ цьому метод≥ використовуЇтьс€ неоднор≥дне переривчасте середовище гелю. Ќа в≥дм≥ну в≥д електрофорезу в однор≥дному середовищ≥, при диск-електрофорез≥ значенн€ рЌ та розм≥ри пор гелю неоднаков≥ в р≥зних частинах колонки. ¬ерхн≥й шар гелю (концентруючий) маЇ меншу концентрац≥ю ≥ б≥льш≥ розм≥ри пор ≥ готуЇтьс€ у буфер≥ з низькою йонною силою та р≥зними значенн€ми рЌ. Ќижн≥й шар гелю (розд≥л€ючий) маЇ мал≥ розм≥ри пор та ≥нш≥ значенн€ рЌ. ” верхньому шар≥ молекули речовин, що розд≥л€ютьс€, завд€ки б≥льшим порам рухаютьс€ швидше ≥ затримуютьс€ менше, н≥ж у нижньому.  р≥м того, у верхньому шар≥ напружен≥сть електричного пол€ б≥льша завд€ки б≥льшому електричному опору, €кий створюЇ менша йонна сила. –≥зниц€ значень рЌ теж створюЇ ефект б≥льшоњ швидкост≥ руху речовин, €к≥ розд≥л€ютьс€, у верхньому шар≥.

¬се це забезпечуЇ утворенн€ в гел≥ зон в≥дпов≥дно до компонент≥в, що розд≥л€ютьс€, а саме до концентрац≥њ молекул з близькою рухлив≥стю.

ћетод диск-електофорезу в пол≥акрилам≥дному гел≥ маЇ переваги над ≥ншими методами зонального електрофорезу тому, що в ньому використовуЇтьс€ розд≥ленн€ речовин не т≥льки за њхньою рухлив≥стю в гел≥ п≥д д≥Їю електричного пол€, а також в результат≥ ефекту молекул€рного сита та ефекту концентрац≥њ.

ƒл€ препаративного розд≥ленн€ сум≥ш≥ речовин застосовують також низьковольтний проточний електрофорез. —уть цього методу пол€гаЇ в наступному. ” човник, розташований у верхн≥й частин≥ електрофоретичноњ камери, внос€ть забуферений розчин сум≥ш≥ досл≥джуваних речовин. « човника цей розчин безперервно поступаЇ у верхню частину вертикально розташованого листка ф≥льтру≠вального паперу певноњ щ≥льност≥. ѕап≥р попередньо просочуЇтьс€ цим же буферним розчином. ƒо бок≥в паперу приЇднуютьс€ електроди Ц катод ≥ анод. –озчин речовин, €к≥ треба розд≥лити, ст≥каЇ по паперу вниз п≥д д≥Їю сили т€ж≥нн€. ѕроход€чи через електричне поле, що д≥Ї в перпендикул€рному напр€мку до руху розчину, вниз, зар€джен≥ частинки речовин перем≥щуютьс€ в горизонтальному напр€мку до в≥дпов≥дних електрод≥в у залежност≥ в≥д величини њх зар€д≥в з р≥зними швидкост€ми. «разок на нижньому крањ паперу капаЇ ≥з вир≥заних у папер≥ зубц≥в у р€д розм≥щених проб≥рок, тобто в проб≥рках збираютьс€ певн≥ фракц≥њ розд≥лених речовин.

÷ей метод потребуЇ експериментального п≥дбору умов прове≠ден≠н€ електрофорезу: швидкост≥ току буферного розчину, його складу, рЌ, визначенн€ м≥сц€ нанесенн€ зразка та ≥н. «а цим методом отримують фракц≥њ б≥лк≥в, пептид≥в, ам≥нокислот, ≥нших невеликих молекул.

ƒл€ того, щоб виключити можливу адсорбц≥ю речовин на папер≥, застосовують метод проточного електрофорезу без нос≥€. ƒл€ цього буферний розчин з розчиненими в ньому речовинами, €к≥ треба розд≥лити, пост≥йно тече з резервуару м≥ж дуже близько розташованими скл€ними пластинками, до бок≥в €ких приЇднуютьс€ електроди, зТЇднан≥ з в≥дпов≥дними полюсами джерел пост≥йного струму. „ерез р€д кон≥чних отвор≥в на нижньому к≥нц≥ пластинок в≥дбираютьс€ р≥зн≥ фракц≥њ.

“аким чином, електрофорез у тонкому шар≥ р≥дини (проточний електрофорез у в≥льному середовищ≥) Ї р≥зновидн≥стю зонального електрофорезу без середовища п≥дтримки.

ѕри розд≥ленн≥ речовин методом електрофорезу низькомолекул€рних речовин доц≥льно використовувати високовольтний електрофорез (електрична напруга Ц до 10000 ¬, сила струму Ц до 500 мј). «а таких умов значно пол≥пшуЇтьс€ розд≥ленн€ ≥ процес прот≥каЇ швидше. ќднак при високовольтному електрофорез≥ вид≥л€Їтьс€ велика к≥льк≥сть тепла ≥ це потребуЇ спец≥альних метод≥в охолодженн€. Ќайчаст≥ше дл€ охолодженн€ використовують дв≥ алюм≥н≥Їв≥ пластини, €к≥ через ≥золююч≥ прокладки з пол≥етилену притискаютьс€ з двох бок≥в до листка нос≥€. –озм≥ри цих пластин дос€гають 50×50 см, мають канали дл€ циркул€ц≥њ води на зразок пластин морозильних камер холодильник≥в.

” метод≥ ≥зотахофорезу вс≥ зар€джен≥ молекули в електричному пол≥ рухаютьс€ з однаковою швидк≥стю. —початку вони розпод≥л€ютьс€ в≥дпов≥дно до величини зар€ду ≥ рухливост≥, а пот≥м перем≥щуютьс€ в електричному пол≥ з однаковою ≥ пост≥йною швидк≥стю. ÷ей метод маЇ дуже високу розпод≥льну здатн≥сть ≥ використовуЇтьс€ €к дл€ анал≥тичного, так ≥ дл€ препаративного розд≥ленн€ речовин. ¬ основ≥ цього методу лежить принцип фронтального електрофорезу (метод рухомоњ меж≥). ¬ залежност≥ в≥д конструкц≥њ на€вного обладнанн€, розд≥ленн€ провод€ть у горизонтальному або вертикальному напр€мках. –озчин, в €кому в≥дбуваЇтьс€ розд≥ленн€, м≥стить, €к правило, сахарозу дл€ забезпеченн€ б≥льшоњ щ≥льност≥. —уть ≥зотахофорезу пол€гаЇ в наступному. «разок ввод€ть м≥ж ведучим електрол≥том, €кий м≥стить йони з б≥льшою рухлив≥стю, н≥ж йони досл≥джуваних речовин, ≥ замикаючим електрол≥том, €кий м≥стить йони з меншою рухлив≥стю, н≥ж йони зразка. …они речовин, €к≥ розд≥л€ютьс€, а також йони ведучого ≥ замикаючого електрол≥т≥в мають однаковий знак зар€ду. ƒл€ дос€гненн€ необх≥дних значень рЌ ≥ буферноњ Їмност≥ розчини зразка, ведучого та замикаючого електрол≥т≥в мають в≥дпов≥дн≥ проти≥они. ¬ електричному пол≥ вс≥ зар€джен≥ йони спочатку рухаютьс€ з≥ швидк≥стю, €ка визначаЇтьс€ напружен≥стю електричного пол€, величиною зар€ду ≥ рухлив≥стю. ¬едуч≥ йони, €к≥ мають високу рухлив≥сть, рухаютьс€ з б≥льшою швидк≥стю ≥ накопичуютьс€ в зон≥ анода (€кщо вони зар€джен≥ негативно). «она ведучих йон≥в характеризуЇтьс€ п≥двищеною концентрац≥Їю йон≥в з високою рухлив≥стю. ¬≥дпов≥дно до цього вона матиме найменший електричний оп≥р, що спричинить низьку напружен≥сть електричного пол€. «она ведучих йон≥в маЇ також низьке значенн€ рЌ ≥ меншу температуру.

¬насл≥док зменшенн€ концентрац≥њ ведучих йон≥в за межами њхньоњ зони п≥двищуЇтьс€ електричний оп≥р у систем≥, що призводить до п≥двищенн€ напруженост≥ електричного пол€, у звТ€зку з чим п≥двищуЇтьс€ швидк≥сть м≥грац≥њ йон≥в досл≥джуваних речовин, €к≥ рухаютьс€ сл≥дом за ведучими йонами.

¬едуч≥ йони та йони речовин, €к≥ розд≥л€ютьс€, майже не зм≥шуютьс€.  оли певна частина йон≥в досл≥джуваного зразка все ж таки потрапить у зону ведучих йон≥в, €ка характеризуЇтьс€ низькою напружен≥стю електричного пол€ через велику концентрац≥ю йон≥в з високою рухлив≥стю, то швидк≥сть йон≥в зразка р≥зко зменшитьс€ ≥ вони в≥дстануть в≥д ведучих йон≥в; €кщо ж ведуч≥ йони попадуть у зону йон≥в зразка, то внасл≥док високоњ напруженост≥ електричного пол€ в ц≥й зон≥ швидк≥сть руху њх р≥зко зб≥льшитьс€, ≥ вони опин€тьс€ в характерн≥й дл€ них зон≥. “аким чином, внасл≥док того, що зона йон≥в речовин, €к≥ розд≥л€ютьс€, характеризуЇтьс€ нижчою концентрац≥Їю йон≥в ≥ меншою, н≥ж у ведучих йон≥в рухлив≥стю, але б≥льшою напружен≥стю електричного пол€ ≥ вищим значенн€м рЌ, в≥дбуваЇтьс€ автоматична стаб≥л≥зац≥€ м≥ж зонами.

«а йонами досл≥джуваного зразка рухаютьс€ замикаюч≥ йони, €к≥ мають менший електричний зар€д ≥ рухлив≥сть, н≥ж йони зразка. ƒл€ них йони зразка Ї ведучими, тому вони не здатн≥ њх випередити ≥ також спричин€ють звуженн€ зони зразка.

” м≥ру звуженн€ зони зразка концентрац≥€ йон≥в у н≥й п≥двищуЇтьс€, в≥дпов≥дно зменшуЇтьс€ њњ електричний оп≥р, що призводить до пад≥нн€ напруженост≥ електричного пол€ в ц≥й зон≥. “акий процес буде в≥дбуватис€ до моменту стаб≥л≥зац≥њ системи, коли швидк≥сть руху вс≥х йон≥в Ц ведучих, зразка ≥ замикаючих Ц стане р≥вною. …они зразка будуть Ђстиснутимиї м≥ж ведучими ≥ замикаючими йонами у вузьк≥й зон≥, ширина €коњ та концентрац≥€ в н≥й йон≥в значною м≥рою залежить в≥д концентрац≥њ та рухливост≥ ведучих йон≥в.

якщо зразок м≥стить дек≥лька йон≥в з р≥зною рухлив≥стю, то вони будуть розм≥щуватис€ м≥ж замикаючими ≥ ведучими йонами в м≥ру зменшенн€ њхньоњ рухливост≥ у вигл€д≥ дискретних зон, €к≥ контактують м≥ж собою, але м≥ст€ть т≥льки певн≥ йони. ѕ≥сл€ дос€гненн€ р≥вноваги ≥ розд≥ленн€ йон≥в зразка в систем≥ виникаЇ град≥Їнт рЌ, напруженост≥ електричного пол€ ≥ температури.

” випадку, коли рухливост≥ йон≥в зразка близьк≥, розд≥льну здатн≥сть ≥зотахофорезу можна п≥двищити шл€хом внесенн€ у зразок амфол≥т≥в. ѓх п≥дбирають таким чином, щоб вони мали пром≥жну рухлив≥сть пор≥вн€но з йонами зразка ≥ розм≥щувалис€ м≥ж ними, що п≥двищуЇ розд≥ленн€.

ƒл€ анал≥зу низькомолекул€рних йон≥в орган≥чних речовин використовують, €к правило, анал≥тичний ≥зотахофорез у скл€них або пластмасових трубочках (кап≥л€рах) завдовжки 50-100см ≥ з внутр≥шн≥м д≥аметром 0,4-0,6мм. як розд≥л€юч≥ йони використовують в≥дпов≥дн≥ амфол≥ти, а також вал≥н, алан≥н та ≥нш≥ речовини.

ќск≥льки в зонах розд≥ленн€ створюютьс€ р≥зн≥ град≥Їнти електричноњ напруги, в них вид≥л€Їтьс€ неоднакова к≥льк≥сть тепла Ц чим менша напружен≥сть електричного пол€, тим менше вид≥л€Їтьс€ тепла. ÷е €вище використовуЇтьс€ дл€ ви€вленн€ зон при ≥зотахофорез≥, дл€ чого вим≥рюють њхню температуру термометром, термопарою, терм≥стором тощо. ƒ€ визначенн€ зон при ≥зотахофорез≥ використовують також детектори пров≥дност≥ град≥Їнта електричного потенц≥алу (м≥кроелектроди). –ечовини, €к≥ здатн≥ поглинати ультраф≥олетове випром≥нюванн€, можна реЇструвати високочутливими детекторами в ц≥й област≥.

І 84. «апитанн€ дл€ самоперев≥рки та контрольн≥ запитанн€
з електрох≥м≥чних метод≥в анал≥зу

1. Ќавед≥ть класиф≥кац≥ю електрох≥м≥чних метод≥в анал≥зу.

2. «а €ким показником проводитьс€ анал≥з вм≥сту досл≥джуваноњ речовини в кондуктометр≥њ?

3. „им обумовлена електропров≥дн≥сть розчин≥в електрол≥т≥в?

4. „им обумовлений оп≥р електропров≥дност≥ у розчинах електрол≥т≥в?

5. Ќавед≥ть математичне вираженн€ питомоњ електропров≥дност≥ розчину.

6. „ому питома електропров≥дн≥сть розчину електрол≥ту зб≥льшуЇтьс€ ≥з зростанн€м концентрац≥њ розчину до певноњ меж≥, а пот≥м знижуЇтьс€?

7. ўо таке екв≥валентна електропров≥дн≥сть розчину електрол≥ту?

8. як звТ€зан≥ м≥ж собою екв≥валентна, питома електропров≥дност≥ ≥ концентрац≥€ розчину електрол≥ту?

9. ўо таке гранична електропров≥дн≥сть розчину електрол≥ту ≥ в≥д €ких фактор≥в вона залежить?

10. „им по€снюЇтьс€ зменшенн€ екв≥валентноњ електропров≥дност≥ розчин≥в сильних електрол≥т≥в?

11. ” чому суть закону  ольрауша щодо електропров≥дност≥ розчин≥в електрол≥т≥в?

12. „им по€снюЇтьс€ аномально висока рухлив≥сть г≥дроген-≥он≥в та г≥дроксид-≥он≥в у водних розчинах електрол≥т≥в?

13. „им по€снюютьс€ ефекти деформац≥йноњ та ор≥Їнтац≥йноњ пол€ризац≥њ у розчин≥, що знаходитьс€ в електричному пол≥ високоњ частоти?

14. як≥ Ї типи кондуктометричних ком≥рок?

15. ” чому суть низькочастотного кондуктометричного титруванн€? яка область його застосуванн€?

16. ” чому суть пр€моњ кондуктометр≥њ?

17. ўо таке високочастотне кондуктометричне титруванн€ ≥ чим воно в≥др≥зн€Їтьс€ в≥д низькочастотного? ” €ких випадках застосовують високочастотне кондуктометричне титруванн€?

18. Ќа чому ірунтуютьс€ потенц≥ометричн≥ методи анал≥зу?

19. Ќавести математичне вираженн€ величини потенц≥алу ≥ндикаторного електрода.

20. ўо таке електрод пор≥вн€нн€ ≥ €к≥ бувають види таких електрод≥в?

21. як≥ бувають види ≥ндикаторних електрод≥в?

22. ќпиш≥ть будову ≥ принцип д≥њ скл€ного ≥ндикаторного електрода.

23. «а €ким принципом вибирають електрол≥т дл€ сольового м≥стка у гальван≥чному елемент≥?

24. ” чому суть пр€моњ потенц≥ометр≥њ?

25. « €кою метою у досл≥джуваний та стандартний розчини у пр€м≥й потенц≥ометр≥њ ввод€ть надлишок ≥ндиферентного електрол≥ту?

26. ” чому суть потенц≥ометричного титруванн€ ≥ в €ких випадках застосовуЇтьс€ цей метод?

27. Ќа чому базуЇтьс€ метод пол€рограф≥чного анал≥зу?

28. ўо таке концентрац≥йна пол€ризац≥€ електрода?

29. ўо таке дифуз≥йний або граничний струм у пол€рограф≥њ? яку ≥нформац≥ю даЇ величина такого струму?

30. ” чому переваги пол€рограф≥чного методу анал≥зу над ≥ншими методами?

31. яку ≥нформац≥ю дл€ досл≥дника даЇ пол€рограф≥чна хвил€?

32. який параметр пол€рограф≥чноњ хвил≥ використовуЇтьс€ дл€ ≥дентиф≥кац≥њ досл≥джуваноњ речовини?

33. як≥ електроди застосовуютьс€ в пол€рографах?

34. ўо таке пол€рограф≥чний фон ≥ дл€ чого в≥н застосовуЇтьс€?

35. як≥ вимоги повинн≥ задовольн€ти ≥ндиферентн≥ електрол≥ти, що застосовуютьс€ в пол€рограф≥њ?

36. як≥ област≥ застосуванн€ пол€рограф≥чного анал≥зу?

37. ” чому суть методу амперометричного титруванн€?

38. ” чому переваги амперметричного титруванн€ над пол€рограф≥Їю?

39. ” чому суть кулонометричного анал≥зу?

40. який закон лежить в основ≥ кулонометричного анал≥зу? ƒати математичне вираженн€ цього закону.

41. який найб≥льш важливий показник суттЇво в≥др≥зн€Ї кулонометричний анал≥з в≥д ≥нших метод≥в анал≥зу?

42. який параметр процесу в кулонометричному анал≥з≥ сл≥д строго дотримувати?

43. якими методами визначаЇтьс€ момент к≥льк≥сного завершенн€ електрох≥м≥чноњ реакц≥њ в кулонометричному анал≥з≥?

44. ” чому суть методу кулонометричного титруванн€?

45. ” чому переваги кулонометричного титруванн€ над звичайним титруванн€м?

46. якими методами визначають к≥льк≥сть електрики, €ка необх≥дна дл€ прот≥канн€ електрох≥м≥чноњ реакц≥њ, в кулонометр≥њ?

47. ” чому сутн≥сть електрофоретичних метод≥в анал≥зу?

48. як≥ параметри зар€джених частинок та параметри електричного пол€ визначають швидк≥сть руху частинок в електричному пол≥?

49. як впливаЇ характер буферу на електрофоретичну рухлив≥сть частинок?

50. як≥ вимоги предТ€вл€ютьс€ до нос≥њв, в порах €ких в≥дбуваЇтьс€ електрофорез?

51. якими способами ви€вл€ють фракц≥њ речовин на електрофореграмах?

52. ” чому сутн≥сть ≥онофорезу?

53. ƒл€ €ких ц≥лей застосовують препаративний та анал≥тичний електрофорези?

54. ” чому сутн≥сть фронтального та зонального електрофорез≥в та €к≥ област≥ њх застосуванн€?

55. ” чому сутн≥сть ≥ техн≥ка виконанн€ електрофорезу в пол≥акрилам≥дному гел≥?

56. ” чому сутн≥сть ≥зотахофорезу та в €ких випадках в≥н застосовуЇтьс€?

 





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-01-29; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 3998 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

„еловек, которым вам суждено стать Ц это только тот человек, которым вы сами решите стать. © –альф ”олдо Ёмерсон
==> читать все изречени€...

1309 - | 1228 -


© 2015-2024 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.074 с.