Определение белка в молоке по Лоури

Принцип метода основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10 – 100 мкг белка в пробе).

Ход работы. 1мл молока вносят в литровую колбу и доводят до 1 л дистиллированной водой. После тщательного перемешивания в пробирку отбирают 2 мл разбавленного молока, добавляют 5 мл реактива С, после чего содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем приливают 0,5 мл реактива Фолина и колориметрируют после 45 минутной выдержки при l = 750нм (красный светофильтр). Концентрацию белка молока (D_оп) в пробе находят по предварительно построенной калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривой. 10 мл приготовленного 0,1%-ного раствора белка казеина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Из полученного таким образом раствора в 7 пробирок отбирают порции, содержащие от 20 до 150 g казеина (1мг = 1000 g). Раствор казеина и воду вносят в количествах, указанных в таблице 6. Параллельно готовят контрольную пробу, для этого в пробирку вносят 2 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку (в том числе и в контрольную) добавляют 5 мл реактива С, после чего содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем приливают 0,5 мл реактива Фолина и колориметрируют после 45 минутной выдержки при l = 750нм (красный светофильтр), концентрацию белка в пробе откладывают на оси абсцисс, по оси ординат – величину оптической плотности (D_ср) при 750нм (рисунок 4).

D_ср

D_оп

20 40 60 80 100 120 140 С×10^-6, г/мл

Рисунок 4 - График зависимости оптической плотности (D) от концентрации белка в пробе (С)

Концентрацию белка в молоке рассчитывают по формуле

, (5)

где К – концентрация белка в молоке, %;

с - концентрация казеина в пробе, найденная по графику, г/мл;

0,002054 – количество молока в пробе (в 2 мл, взятых для анализа), г.

Таблица 3 - Основные параметры опыта и его результаты

g казеина

Кол-во 0,1%-ного раствора казеина, мл 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

Кол-во Н₂О, мл 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6

Концентрация казеина, г/мл 20×10^-6 40×10^-6 60×10^-6 80×10^-6 100×10^-6 120×10^-6 140×10^-6

Оптическая плотность D₁

D₂

D_ср

Материалы и реактивы: молоко; 0,1% раствор белка казеина по Гаммарстену на фосфатном буфере (см. приложение Б п.10); реактив А (см. приложение Б п.11); реактив В (см. приложение Б п.12); реактив С (см. приложение Б п.13); реактив Фолина ((см. приложение Б п.14).

Оборудование: пробирки; мерные колбы на 1 л, 100 мл; пипетки на 1 и 2 мл с ценой деления 0,05 мл; ФЭК-56М.

Контрольные вопросы

1. Химизм метода Кьельдаля.

2. Коэффициенты пересчета азота на белок.

3. Методика работы на аппарате Сереньева.

4. Схема определения азотосодержащих соединений в сыре.

5. Принцип метода определения белка по методу Лоури.

6. Методика построения калибровочной кривой.