Принцип метода основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10 – 100 мкг белка в пробе).
Ход работы. 1мл молока вносят в литровую колбу и доводят до 1 л дистиллированной водой. После тщательного перемешивания в пробирку отбирают 2 мл разбавленного молока, добавляют 5 мл реактива С, после чего содержимое пробирки перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем приливают 0,5 мл реактива Фолина и колориметрируют после 45 минутной выдержки при l = 750нм (красный светофильтр). Концентрацию белка молока (Dоп) в пробе находят по предварительно построенной калибровочной кривой.
Построение калибровочной кривой. 10 мл приготовленного 0,1%-ного раствора белка казеина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Из полученного таким образом раствора в 7 пробирок отбирают порции, содержащие от 20 до 150 g казеина (1мг = 1000 g). Раствор казеина и воду вносят в количествах, указанных в таблице 6. Параллельно готовят контрольную пробу, для этого в пробирку вносят 2 мл дистиллированной воды. В каждую пробирку (в том числе и в контрольную) добавляют 5 мл реактива С, после чего содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем приливают 0,5 мл реактива Фолина и колориметрируют после 45 минутной выдержки при l = 750нм (красный светофильтр), концентрацию белка в пробе откладывают на оси абсцисс, по оси ординат – величину оптической плотности (Dср) при 750нм (рисунок 4).
Dср
Dоп
20 40 60 80 100 120 140 С×10-6, г/мл
Рисунок 4 - График зависимости оптической плотности (D) от концентрации белка в пробе (С)
Концентрацию белка в молоке рассчитывают по формуле
, (5)
где К – концентрация белка в молоке, %;
с - концентрация казеина в пробе, найденная по графику, г/мл;
0,002054 – количество молока в пробе (в 2 мл, взятых для анализа), г.
Таблица 3 - Основные параметры опыта и его результаты
| g казеина | |||||||
| Кол-во 0,1%-ного раствора казеина, мл | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | 1,2 | 1,4 |
| Кол-во Н2О, мл | 1,8 | 1,6 | 1,4 | 1,2 | 1,0 | 0,8 | 0,6 |
| Концентрация казеина, г/мл | 20×10-6 | 40×10-6 | 60×10-6 | 80×10-6 | 100×10-6 | 120×10-6 | 140×10-6 |
| Оптическая плотность D1 | |||||||
| D2 | |||||||
| Dср |
Материалы и реактивы: молоко; 0,1% раствор белка казеина по Гаммарстену на фосфатном буфере (см. приложение Б п.10); реактив А (см. приложение Б п.11); реактив В (см. приложение Б п.12); реактив С (см. приложение Б п.13); реактив Фолина ((см. приложение Б п.14).
Оборудование: пробирки; мерные колбы на 1 л, 100 мл; пипетки на 1 и 2 мл с ценой деления 0,05 мл; ФЭК-56М.
Контрольные вопросы
1. Химизм метода Кьельдаля.
2. Коэффициенты пересчета азота на белок.
3. Методика работы на аппарате Сереньева.
4. Схема определения азотосодержащих соединений в сыре.
5. Принцип метода определения белка по методу Лоури.
6. Методика построения калибровочной кривой.
