Изучение аллостерических свойств а-амилазы
Принцип метода. Некоторые лекарственные препараты и хлориды металлов могут оказывать аллостерическое влияние на активность амилазы. Активность амилаза определяется фотометрически по уменьшению количества крахмала в ходе его гидролиза под действием амилазы. Крахмал выявляется в цветной реакции с йодом. Для создания среды, оптимальной для работы фермента, используется фосфатный буфер рН 7,2.
Ход работы.
1). Приготовление раствора амилазы. Собирают в пробирку 0.5 мл не разведенной слюны, доводят объем до 10 мл дистиллированной водой и тщательно перемешивают содержимое пробирки.
2). Приготовление раствора лекарственного препарата. Таблетку растирают в ступке, порошок растворяют в буфере и количественно переносят в мерную колбу объемом 100 мл, объем жидкости доводят до метки буфером.
3). Инкубация амилазы с лекарственным препаратом: берут 2 стаканчика и смешивают растворы:
1 стаканчик - 1 мл амилазы в 1 мл буфера;
2 стаканчик - 1 мл амилазы и 1 мл раствора лекарственного препарата.
Инкубируют 15 минут при 37°С (термостат).
4). Определение активности амилазы. Берут 3 пробирки и вносят следующие растворы:
1 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №1;
2 пробирка - 0,05 мл из стаканчика №2;
3 пробирка - 0,05 мл буфера.
Во все пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала, хорошо перемешивают и инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут. После инкубации в каждую пробирку вносят 1 мл раствора йода и 8 мл дистиллированной воды. Тщательно перемешивают и немедленно измеряют светопоглощение против дистиллированной воды на фотоэлектроколориметре, светофильтр №8, кювета с толщиной слоя 1 см. Записывают величину экстинкции для каждой пробирки (Е1,Е2,Е3).
5). Расчет активности амилазы. Активность амилазы выражают в граммах крахмала, расщепленного 1 литром слюны за 1 час инкубации при 37°С. активность амилазы без лекарственного вещества – А1:
А1=(Е3-Е1)/Е3*80 г/(л*час)
Активность амилазы в присутствии лекарственного вещества - А2:
А2=(Е3-Е2)/Е3*80 г/(л*час)
Сравнивая величины А1 и А3, можно сделать вывод о наличии аллостерических влияний на активность амилазы и их направленности.
Результат: ___________________________________________________________________
_______________________________________
Е1=_________________________
Е2=_________________________
Е3=_________________________
А1=_________________________
А2=_________________________
Вывод_______
____________________________________________________
Лабораторная работа № 7
Количественное определение активности фермента
Действие амилазы на крахмал
Принцип метода. Фермент амилаза осуществляет гидролиз крахмала (гликогена) через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы, а затем глюкозы.
(С6Н10О5)n→(С6Н10О5)х→y С12Н22О11→n С6Н12О6
Нерасщепленный крахмал с йодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от величины своих частиц, дают с йодом фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску или вообще не окрашиваются.
Поэтому, если к раствору крахмала прибавить раствор слюны и через определенные промежутки времени добавлять в пробы 1% раствор йода, то жидкость сначала приобретает синий цвет, а затем — фиолетовый, красный, оранжевый и желтый. Это объясняется тем, что амилаза слюны расщепляет крахмал, образуя ряд промежуточных продуктов. Амилодекстрины и эритродекстрины дают с йодом гамму цветов—от фиолетового до оранжевого. Мальтодекстрины и мальтоза окрашивания с йодом не дают.
Конечные продукты гидролиза крахмала — мальтоза и глюкоза — могут быть обнаружены реакцией Троммера
Ход работы. Сначала готовят раствор амилазы. Для этого собирают небольшое количество слюды (примерно 0,5 мл) и разводят ее дистиллированной, водой. Разведенную слюну используют в качестве источника амилазы. Далее берут 7 пробирок.
В каждую пробирку наливают из бюретки по 1 мл раствора крахмала и добавляют по 1 мл раствора слюны. Затем в пробирки с интервалами по 5 минут добавляют по 1-2 капле раствора Люголя (содержит йод). Пробирки встряхивают, отмечают цвет раствора.
Результат:
| № пробирки | Время инкубации (мин) | Окраска |
Вывод: ______
_______________________________________
IV.ТЕМА НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Лабораторная работа № 8
