Биуретовый метод
Количественное определение белка в биологических жидкостях является обязательным при постановке диагноза многих заболеваний. Существует несколько методов количественного определения белка: колориметрический, спектрофотометрический и др.
Принцип метода. Одним из колориметрических методов количественного определения белка является биуретовый метод, основанный на биуретовой реакции. В щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания в определенных пределах пропорциональна концентрации белка.
Реактивы:
1) биуретовый реактив 3,5 г растворить в 250 мл дистиллированной воды;
2) стандартный раствор с содержанием белка 2,5; 5,0 и 7,5 мг в 1 мл;
Ход работы.
1. В 4 пробирки вносят по 1 мл раствора белка. В первый три пробирки помещают стандартные растворы белка с известной концентрацией. В четвертую пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно определить.
2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют на 20 минут при комнатной температуре для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной 1 см, при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр). В качестве контрольного раствора используют биуретовый реактив.
3. Стоят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Пользуясь этой кривой и зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, определяют в нем содержание белка.
Вывод:_ ___________________
Лабораторная работа № 4
Реакции осаждения белков
Реакции осаждения белков могут быть обратимыми и необратимыми. В первом случае белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе с сохранением своих нативных свойств. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям — денатурации.
Реакции осаждения дают возможность:
1) изучить свойства белков;
2) освободить жидкость от присутствия белка;
3) установить наличие белка в биологических жидкостях, например в моче;
4) высаливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей или спиртом выделить отдельные белковые фракции.
Осаждение белков при кипячении
Принцип метода. Для осаждения белка необходимо разрушить его гидратную оболочку и нейтрализовать его заряд. При кипячении происходит денатурация, поэтому разрушается гидратная оболочка. Белок теряет заряд, если рН раствора близок к изоэлектрической точке этого белка.
Реактивы:
1) 1 % раствор яичного белка;
2) 1 % раствор уксусной кислоты;
3) 10 % раствор NaOH;
4) насыщенный раствор NaCI;
Ход работы.
В 5 пробирок вносят по 5 капель 1 % раствора яичного белка.
Затем добавляют:
во вторую пробирку - 1 каплю уксусной кислоты;
в третью - 10 капель уксусной кислоты;
в четвертую - 5 капель уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора NaCI;
в пятую - 2 капли NaОН.
Все пробирки кипятят 5 минут в водяной бане. Результаты оформляют в виде таблицы
Результат:
| № пробирки | Ход анализа, реакция среды | Наличие осадка (есть или нет) | Произошла ли денатурация (да или нет) | Наличие факторов стабилизации | |
| Гидратная оболочка (есть или нет) | Заряд (если есть заряд, указать его знак) | ||||
| Нагреть до кипения, нейтральная | |||||
| Нагреть до кипения + слабокислая | |||||
| Сильнокислая + нагреть до кипения, | |||||
| Кислая +электролит + нагреть до кипения | |||||
| Щелочная + нагреть до кипения, |
Вывод: ______
____________________________________________________
