Принцип метода. Нуклеопротеиды – сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты. В кислой среде происходит ослабление ионного взаимодействия между белком и нуклеиновыми кислотами и их разделение. При последующем нагревании гидролиз протекает до аминокислот, пуриновых или пиримидиновых оснований, рибозы или дезоксирибозы, фосфорной кислоты.
Реактивы:
1. пекарские дрожжи;
2. 10% раствор H2SO4;
3. 10% раствор NaOH;
4. 1% раствор CuSO4;
5. аммиак концентрированный;
6. 1% раствор нитрата серебра;
7. 1% спиртовой раствор тимола (или нафтола);
8. концентрированная H2SO4;
9. 30% раствор NaOH;
10. 7% раствор СuSO4;
11. молибденовый реактив;
12. 1% раствор дифениламина.
Ход работы: 1 г пекарских дрожжей помещают в круглодонную колбу. Добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты, 20 мл воды и закрывают пробкой с обратным холодильником. Кипятят 40-50 мин. Охлаждают, переливают в цилиндр. Доводят до первоначального объема и фильтруют.
С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов:
Проба на пептиды: 5 капель гидролизата смешивают с 10 каплями 10% раствора NaOH и 1 каплей 1 % раствора CuSO4. Содержимое окрашивается в розовый цвет.
Проба на пуриновые основания: к 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного аммиака и 5 капель 1 % раствора нитрата серебра. Через 3-5 амин появляется бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.
Проба на пентозы (реакция Молиша): к 10 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли 1% спиртового раствора тимола (или нафтола). Содержимое перемешивают и по стенке приливают 20 капель концентрированной серной кислоты.
При встряхивании образуется красное окрашивание продукта конденсации фурфурола с тимолом, образовавшимся из пентозы.
Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу: к 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30% раствора NaOH и 1-3 капли 7% раствора СuSO4 до появления неисчезающей мути Cu(OH)2 перемешивают. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) или красный осадок оксида меди (I).
Качественная реакция на рибозу и дезоксирибозу с дифениламином: дифениламин дает синее окрашивание с дезоксирибозой и зеленое - с рибозой. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1% раствора дифениламина и пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Развивается сине-зеленое окрашивание.
Проба на фосфорную кислоту: к 3-5 каплям гидролизата прибавляют 20 капель молибденового реактива (7,5 г молибдена аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты с относительной плотностью 1,2) и кипятят несколько минут. Развивается желтое окрашивание. Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.
Результат: ___________________________________________________________________
____________________________________________________
Вывод_______
______________________________________
V.ТЕМА: БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ
Лабораторная работа № 9
Обнаружение НАД в дрожжах
Принцип метода НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, богаты им и дрожжи. НАД легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном. Эта реакция характерна для N-производных амида никотиновой кислоты. Она применяется для определения метилникотинамида в моче.
Реактивы:
- дрожжи,
- ацетон,
- 30% раствор NaOH,
- спиртовой раствор фенолфталеина.
Ход работы. В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4—5 мм, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20—30с, не допуская выбрасывания жидкости. Отфильтровывают в пустую пробирку 5—10 капель полученного экстракта, добавляют 3—5 капель ацетона и 1—2 капли 30% раствора едкого натра. Оставляют пробирку на 2 мин; затем добавляют 1 каплю 5 г/л спиртового раствора фенолфталеина и по каплям концентрированную соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Поместить пробирку на 2 мин в кипящую водяную баню, затем охладить и поднести к включенному флюориметру. Ацетоновый комплекс НАД флюоресцирует, синим светом.
Результат: __________________________________________________________________
__________________________
Вывод_______
_______________________________________
Лабораторная работа № 10
