Принцип метода. Ферменты (энзимы) – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. Свойство ферментов разрушаться при кипячении является характерной особенностью, отличающей ферменты от других катализаторов. Ферменты термолабильны и проявляют оптимальную активность при температуре 35-45˚С. При повышении температуры свыше 50˚С их активность снижается, а затем происходит разрушение структуры молекулы фермента.
Реактивы:
1. слюна 1:10;
2. 1 % раствор крахмала;
3. раствор Люголя.
Ход работы. В 4 пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Пометают пробирки в разные температурные условия;
1 пробирка - в лед (0°С);
2 пробирка - оставляют при комнатной температуре (20°С);
3 пробирка - и термостат при 37°С;
4 пробирка - в кипящую водяную баню (100°С).
Через 5 минут во все пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала и оставляют их на 10 минут для инкубации в тех же условиях. После инкубации результат действия амилазы на крахмал оценивается с помощью качественной реакции крахмала с йодом: в присутствии крахмала развивается синяя окраска, а при его отсутствии синей окраски не появляется, а остается желтая окраска йода. Таким образом, после инкубация все пробирки охлаждают под краном и добавляют по 2 капли раствора Люголя (содержит йод). Отмечают окраску содержимого пробирок.
Результат:
1 пробирка:_____________________________________________
2 пробирка:_____________________________________________
3 пробирка:_____________________________________________
4 пробирка:_____________________________________________
Вывод: _____
____________________________________________________
Влияние рН среды на активность ферментов
Принцип метода. Для амилазы слюны оптимальное значение рН среды 6,8. В кислой и щелочной среде активность амилазы снижается, и расщепление крахмала идет до стадии декстринов, которые с раствором Люголя дают красно-фиолетовую или красно-бурую окраску.
Реактивы:
1. Слюна, раствор 1:10;
2. 1 % раствор крахмала;
3. 1 % Na2HPO4;
4. 1 % NaH2PO4;
5. раствор Люголя.
Ход работы. В 3 пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Затем создают среду с различным рН:
пробирка №1 - добавляют 1 мл дистиллированной воды (нейтральная среда);
пробирка №2 - добавляют 1 мл Na2HPO4 (щелочная среда);
пробирка №3 - добавляю 1 мл NaH2PO4 (кислая среда).
После этого в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала. Зятем все пробирки помешают в термостат (37°С) на 10 минут. После инкубации пробирки охлаждают. Содержимое второй пробирки нейтрализуют добавлением 2 мл NaH2PO4, так как крахмал в щелочной среде не дает окраска с йодом. Результат оценивается, затем добавить во все пробирки добавляют по 2 капли раствора Люголя. Отмечают окраску содержимого пробирок.
Результат:
Пробирка № 1_____________________________________________________
Пробирка № 2_____________________________________________________
Пробирка № 3_____________________________________________________
Пробирка № 4_____________________________________________________
Вывод: ______
_______________________________________
Специфичность действия амилазы и сахаразы
Принцип метода. Специфичностью называется способность ферментов ускорять отдельные химические реакции только между строго определенными веществами. Результат действия ферментов амилазы и сахаразы на субстраты крахмал и сахарозу оценивается с помощью качественной реакции Фелинга. Крахмал и сахароза не имеют свободных полуацетальных гидроксилов и поэтому не восстанавливают Cu+2 сульфата меди (реактив Фелинга I), которые придают раствору голубую окраску, до Сu2О (осадок кирпично-красного цвета), то есть дают отрицательную реакцию Фелинга, а продукты расщепления крахмала и сахарозы (мальтоза и глюкоза) имеют свободные полуацетальные гидроксилы и дают положительную реакцию Фелинга.
Реактивы:
1. 1 % раствор крахмала;
2. 2 % раствор сахарозы;
3. слюна 1:10;
4. сахараза из дрожжей;
5. 10 % NaOH;
6. раствор Люголя.
Ход работы.
Берут 4 пробирки и вносят реактивы по следующей схеме.
1 пробирка - 2 мл сахарозы и 0.5 мл разведенной слюны;
2 пробирка - 2 мл сахарозы и 0.5 мл сахаразы;
3 пробирка - 2 мл крахмала и 0.5 мл разведенного слюны;
4 пробирка - 2 мл крахмала и 0.5 мл сахаразы.
Содержимое пробирок хорошо перемешивают и ставят на 10 минут в термостат (37°С). После инкубации во все пробирки добавляют по 5 капель реактива Фелинга I, по 5 капель реактива Фелинга II и ставят в кипящую баню на 2 минуты. Отмечают изменения окраски.
Результат:
Пробирка № 1_____________________________________________________
Пробирка № 2_____________________________________________________
Пробирка № 3_____________________________________________________
Пробирка № 4_____________________________________________________
Вывод: _____
____________________________________________________
Лабораторная работа № 6
