Принцип метода Диализ — освобождение коллоидов от низкомолекулярных органических и минеральных примесей с помощью диффузии последних через мембраны. Белки в растворе благодаря значительной величине молекул не диффундируют сквозь полупроницаемую мембрану.
Реактивы:
1) 1 % раствор яичного белка с примесью NaCI;
2) 10 % раствор NaOH;
3) 1 % раствор CuSO4.
Ход работы: Наливают 15—20 мл исследуемого солевого раствора белка в целлофановый мешочек (диализатор) и погружают его в стакан с дистиллированной водой таким образом, чтобы открытый край мешочка выступал над поверхностью воды. Через 1 час с водой из стакана (диализата – наружная жидкость) и раствора белка (диализируемая жидкость), проделывают биуретовую реакцию (на белок) и реакцию на хлориды, чтобы убедиться в отсутствии белка и наличии минеральных солей в воде из стакана.
Биуретовая реакция на белок в диализируемой жидкости. К 5 каплям раствора из мешочка прибавить 3 капли 10% раствора NaOH и 1 каплю 1% раствора CuSO4, перемешать.
Результат: ___________________________________________________________________
_____________
Биуретовая реакция на белок в диализате. К 5 каплям диализата прибавить 3 капли 10% раствора NaOH и 1 каплю 1% раствора CuSO4, перемешать.
Результат: ___________________________________________________________________
_____________
Реакция на хлорид в диализате. К 10 каплям диализата прибавить 1 каплю 10 % раствора HNO3 и 1 % раствора AgNO3.
Результат: ___________________________________________________________________
_____________
Вывод:______________________________________________
Лабораторная работа № 5
Разделение белков и определение их молекулярной массы методом гель – хроматографии
Принцип метода. Разделительный гель состоит из гранул с определенным размером пор и межгранульного пространства. Молекулы, размер которых превышает размер пор гранул, движутся только в пространстве между гранулами и первыми выходят из колонки. Молекулы, размеры которых меньше размера пор, диффундируют в гранулы и обратно, поэтому их вымывание (элюирование) из колонки замедляется. Чем меньше молекулярная масса вещества, тем больший объем элюирующей жидкости требуется для вымывания его из колонки.
При гель-хроматографии измеряют объем элюирования для каждого вида молекул. Чем больше объем элюирования, тем меньше молекулярная масса молекул. Молекулярную массу исследуемого вещества можно определить с помощью калибровочного графика.
Реактивы:
1) 0,9 % раствор NaCI;
2) гель сефадекса (G-200 или G-100);
3) раствор ненасыщенного голубого декстрана;
4) раствор насыщенного раствора рибофлавина;
5) 20 % раствор гемоглобина;
6) 10 % раствор NaOH;
7) 1 % раствор CuSO4;
8) 0,5 % раствор нингидрина.
Ход работы: Колонку для разделения веществ заполняют гелем сефадекса (G-200 или G-100), полученным при гидратировании сефадекса G-200 изотоническим раствором хлористого натрия. Слой NaCI всегда должен находиться над гелем, чтобы он не высыхал. На поверхность геля наносят 2—3 капли раствора, представляющего собой смесь трех веществ: ненасыщенного раствора голубого декстрана (ММ 107), насыщенного раствора рибофлавина (ММ 3-102) и 200 г/л гемоглобина (ММ 64,6-103). Раствор для фракционирования должен сначала впитаться гелем. Затем в колонку дважды вносят по 2 мл 0,9 % раствор NaCI. После этого подключают капельницу с 0,9 % раствором NaCI, предназначенным для элюирования разделяемых веществ. При разделении смеси для гель-фильтрации необходимо следить, чтобы в колонке был ток жидкости, т.е. открыт зажим снизу. По мере прохождения через колонку элюирующего раствора смесь разделяется на фракции, окрашенные в различные цвета. Каждую фракцию собирают в отдельную пробирку. В соответствии с относительной молекулярной массой быстрее всего элюируется декстран (голубой), а затем гемоглобин (красный) и рибофлавин (желтый). После элюирования смеси колонку промывают изотоническим раствором хлористого натрия до тех пор, пока гель не станет бесцветным, затем закрывают и оставляют небольшой слой раствора над гелем. Только после этого колонку можно использовать повторно.
Для выявления белка с содержимым каждой пробирки проводим биуретовую реакцию: добавляем по 6 капель NaOH и по 2 капли CuSO4. Наблюдают за появлением окраски.
Белки и аминокислоты можно выявить и с помощью нингидриновой реакции.
Для этого в каждую фракцию (пробирку) добавляют по 1 мл нингидринового реактива и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 2 минуты. Во фракциях, содержащих белки или аминокислоты, появляется сине-фиолетовое окрашивание.
Результат: ______________________________
Вывод: ___________________________________________________________
III.ТЕМА: ФЕРМЕНТЫ
Лабораторная работа № 6
Свойства ферментов
