МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мокрота, слизь из носоглотки. Материал берут стерильным ватным тампоном из носоглотки больного ребенка. Для взятия материала у маленьких детей тампон, приготовленный на тонкой эластичной проволоке, вводят через нос.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.2). Бактерио-скопический метод как таковой при диагностике коклюша не применяется. Для быстрого обнаружения и идентификации Bordetella pertussis используют иммунофлюоресцентный метод (см. ниже).
Бактериологическое исследование. Основной метод лабораторной диагностики коклюша. Материал для посева берут с помощью носоглоточного тампона или методом "кашлевых пластинок". Для этого в момент появления кашля открытую чашку Петри с питательной средой подносят ко рту ребенка и держат в течение 6—8 кашлевых толчков. Правильное и раннее взятие материала позволяет выделить возбудителя в начальном периоде болезни от 80—90 % больных. Материал засевают на КУА или кровяные среды — картофельно-глицериновый кровяной агар (среда Борде—Жангу) и молочно-кровяной агар. В питательные среды добавляют пенициллин для угнетения роста посторонней микрофлоры. Колонии B.pertussis на указанных средах обычно появляются через 48—72 ч культивирования. В.parapertussis — несколько раньше: через 24—72 ч. Борде-теллы образуют мелкие (диаметром около 1 мм) выпуклые влажные блестящие колонии. На КУА колонии имеют серовато-кремовый цвет, а на среде Борде—Жангу приобретают жемчужный или ртутный блеск. Колонии В.parapertussis более крупные. На среде Борде—Жангу и молочно-кровяном агаре они образуют ограниченную зону гемолиза. Из колоний, выросших на чашках, готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и микроскопируют. При наличии в мазках овоидных грамотри-цательных палочек ставят ориентировочную реакцию агглютинации с коклюшной и паракоклюшной сыворотками. Затем подозрительные колонии пересевают в пробирки для дальнейшего изучения чистых культур.
Идентификацию выделенной культуры производят на основании комплексного изучения морфологических, культураль-ных, биохимических и серологических свойств (табл. 14.2.2). В отличие от других бордетелл B.pertussis не растет на простом питательном агаре и не изменяет цвета специальных питательных сред.
Таблица 14.2.2. Дифференциальные признаки Bordetella spp.
| Признак | В. pertussis | В. parapertussis | В. bron- chisep- tica |
Рост:
на агаре (простом) — + +
— Коричневая
окраска
на агаре с тирозином + +
Ярко-коричневая окраска Изменение окраски:
КУА — Буро-коричневая —
кровяного агара — Потемнение —
Образование уреазы + + +
Наличие антигенов:
родового (общего) 7 7 7
видового (специфического) 1 14 12
Условные обозначения: (+) — наличие признака; (—) — отсутствие признака; цифрами обозначены номера антигенов.
Для определения уреазы в агглютинационные пробирки вносят 0,3 мл 2 % раствора мочевины, 0,3 мл густой суспензии испытуемой культуры и 2—3 капли 0,1 % спиртового раствора фенолфталеина. В положительном случае через 20—30 мин появляется малиновое окрашивание, указывающее на расщепление мочевины уреазой.
Серологическую идентификацию бордетелл, дифференциацию видов и определение сероваров (серотипирование) проводят в реакции агглютинации с адсорбированными факторными сыворотками. При этом исходят из того, что антиген (фактор) 7 является родовым, а антиген (фактор) 1 присущ только В.рег-tussis, 14 — В.parapertussis и 12 — B.bronchiseptica.
При бактериологической диагностике коклюша может возникнуть необходимость дифференциации бордетелл от Haemophilus influenzae. H.influenzae часто встречается на слизистой оболочке дыхательных путей и вызывает пневмонии и другие воспалительные заболевания дыхательных путей. В отличие от бордетелл H.influenzae растет только на кровяных питательных средах — кровяном агаре, "шоколадном" агаре Левинталя, содержащих гемин и коэнзим дегидрогеназы. Бактериологическое исследование продолжается не менее 5 дней.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Иммунохимические исследования. Метод ИФ: тампоном делают два мазка, высушивают их на воздухе и фиксируют на пламени. Один мазок обрабатывают флюоресцирующими противокок-
люшными антителами, другой — паракоклюшными антителами. Препараты микроскопируют в люминесцентном микроскопе, просматривая не менее 50 полей зрения. О положительном результате свидетельствует обнаружение темных бактериальных клеток с четким светящимся венчиком.
Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Реакции агглютинации и РСК применяют в основном для ретроспективного подтверждения диагноза и дифференциальной диагностики атипичных форм коклюша. Агглютинины в крови больных появляются на 3—4-й неделе заболевания в титрах 1:20 и выше. В условиях массовой вакцинации детей против коклюша диагностическое значение имеет нарастание титра антител в динамике болезни, поэтому реакцию ставят повторно через 4—5 дней.
• Микробиологическая диагностика дифтерии
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: мазки со слизистой оболочки зева и носа, пленки с поверхности миндалин и носоглотки. Материал берут двумя ватными стерильными тампонами, один из которых используют для приготовления мазков, другой — для посева.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериоскопическое исследование (схема 14.2.3). Мазки окрашивают по методу Грама, метиленовым синим по Леффлеру, по Нейссеру. Для Corynebacterium diphtheriae характерно наличие полярно расположенных зерен волютина и расположение в виде буквы "V" (см. рис. 2.2.4). Corynebacterium pseudodiphth-eriae и дифтероиды не имеют зерен волютина или содержат их не на концах, а по длине палочки. Кроме того, сами бактерии располагаются в виде частокола. Применение люминесцентной микроскопии позволяет повысить эффективность исследования. При этом C.diphtheriae можно отличить от других корине-бактерий по коричнево-красному свечению зерен волютина, которое они приобретают после окраски флюорохромом кори-фосфином. Цитоплазма этих бактерий дает зеленое или желтое свечение. Однако C.diphtheriae часто изменяют свою морфологию, в частности при санации зева антибиотиками. В настоящее время бактериоскопическое исследование при дифтерии практически не используют в связи с его низкой надежностью (высокой частотой ложноположительных и ложноотрицатель-ных результатов).
Бактериологическое исследование. Является ведущим мето-
|
дом диагностики дифтерии. Материал засевают на кровяной агар и элективные питательные среды, содержащие теллурит: среда Клауберга (питательный агар с теллуритом натрия, глицерином и дефибринированной кровью) и др. На средах с теллуритом задерживается рост кокков и другой микрофлоры зева, что способствует размножению возбудителя дифтерии. На теллуритовой среде C.diphtheriae образует черные колонии (рис. 14.2.1; на вклейке) за счет восстановления теллурита (биовар gravis формирует колонии серовато-черного цвета с радиальной исчерченностью поверхности, напоминающие цветок маргаритки, биовар mitis — круглые выпуклые колонии черного цвета). Типичные колонии, представленные грамполо-жительными палочками булавовидной формы с характерным расположением, содержащими зерна волютина, пересевают на кровяной агар для получения чистой культуры.
Для подтверждения диагноза дифтерии в первую очередь необходимо установить токсигенность выделенной культуры (способность к продукции дифтерийного токсина). Наличие токсина определяют с помощью различных серологических реакций (преципитации в агаре, ИФА и др.). Применяют также метод ПЦР, позволяющий обнаружить присутствие у выделенных бактерий fox-гена, контролирующего синтез дифтерийного токсина. До последнего времени общепринятым методом определения токсигенности являлась реакция преципитации в агаре с антитоксической противодифтерийной сывороткой. Методы ИФА и ПЦР, разработанные в последние годы, являются более чувствительными и позволяют получить результат в течение 3—5 ч.
Определение токсигенности в реакции преципитации: в чашку Петри с питательным агаром, содержащим 15—20 % лошадиной сыворотки, 0,3 % мальтозы и 0,03 % цистина, кладут полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической противодифтерийной сывороткой, содержащей 5000 АЕ/мл. Чашку подсушивают при 37 °С в течение 30 мин и засевают исследуемые культуры в виде перпендикулярных к бумаге штрихов на расстоянии 0,6—0,8 см от края бумаги. В качестве контроля используют заведомо токсигенную культуру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. При размножении токсигенной культуры в месте соединения токсина с антитоксическими антителами в плотной питательной среде образуется преципитат в виде белых линий — "усов" (см. рис. 10.1.7).
Выделенную культуру идентифицируют и дифференцируют от сходных с ней непатогенных коринебактерий по морфологическим особенностям, культуральным и биохимическим признакам: пробы на цистиназу, уреазу, ферментация углеводов и др. (табл. 14.2.3). В случае выделения нетоксигенной культуры ставят дополнительную реакцию агглютинации с
|
| Таблица 14.2.3. Биологические свойства коринебактерий |
| C.diphtheriae биовар grav/s + биовар mitts + C.xerosis ± C.pseudodiphtheriticum ± |
__ + + + + _ +
+ — + — + + — + — + + — — ±— —
Условные обозначения: (+) — 85—100 % штаммов положительны, (±) — 16—84 % штаммов положительны; (—) — отсутствие признака.
противодифтерийной сывороткой с целью выявления видоспе-цифического антигена С. diphtheriae.
Для определения цистиназы (проба Пизу) в столбик питательного агара с цистином уколом засевают исследуемую культуру. Посевы инкубируют при 37 "С до следующего дня. C.diphtheriae вызывают почернение среды по ходу посева (в результате образования сульфида свинца), вокруг которого появляется зона коричневого цвета, а на глубине 1 см от поверхности агара в среде образуется коричневое "облачко".
Для определения уреазы (проба Закса) готовят спиртовой раствор мочевины и раствор индикатора — фенолового красного, которые перед употреблением смешивают в соотношении 1:9 и разливают по 1—2 мл в агглютинационные пробирки. Затем исследуемые бактерии петлей вносят и растирают по стенке пробирки. После 20—30-минутной инкубации при 37 "С наблюдают расщепление мочевины уреазой, в результате чего среда приобретает красный цвет.
Экспресс-методы диагностики: иммунохимические, биохимические и молекулярно-биологические исследования. Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения tax-гена C.diphtheriae с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
• Диагностические, профилактические и лечебные препараты
Преципитирующие антименингококковые сыворотки. Применяют с диагностической целью для обнаружения менингокок-кового антигена в спинномозговой жидкости (методом встречного иммуноэлектрофореза).
