МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: испражнения больного, рвотные массы, вода, пищевые продукты; при постмор-тальной диагностике: отрезки тонкой кишки и желчный пузырь с частью печени. При необходимости хранения материал
помещают в транспортную среду (буферный солевой раствор с глицерином). Для длительного сохранения рекомендуется полоску фильтровальной бумаги, смоченную в жидких испражнениях, поместить в герметически закрытый пластиковый контейнер — для предохранения от высыхания. Таким образом возбудитель сохраняется в материале до 5 нед.
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и водным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат "висячая" капля, в котором определяют наличие подвижных вибрионов при темнопольной или фазово-контраст-ной микроскопии. Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активно-подвижных вибрионов в препарате "висячая" капля позволяет дать первый предварительный положительный ответ (рис. 13.3.1; на вклейке).
Бактериологическое исследование. Материал засевают в различные жидкие и плотные элективные среды, в частности во флаконы со щелочной пептонной водой (1 % с теллуритом) и на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пептонной воде инкубируют при 37 "С в течение 5—6 ч, на чашках — 10—12 ч. Из голубоватой пленки, образующейся на пептонной воде, или из ее поверхностного слоя делают мазки и препараты "раздавленная" и "висячая" капля. Этот же материал используют для постановки реакции агглютинации на стекле со специфической противохолерной 01-сывороткой. Часть пептонной воды переносят в другую пробирку для постановки нитрозоиндоловой пробы. Для этого добавляют туда же несколько капель серной кислоты. В положительном случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозоиндола под влиянием холерного вибриона. Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептон-ную воду. Наличие грамотрицательных вибрионов, агглютинирующихся 01-сывороткой, позволяет дать второй предварительный ответ. Независимо от полученных результатов продолжают исследование, как показано на схеме 13.3.1.
Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5—6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию агглютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из колоний. Для этого агглютинирующую 01-сыворотку разводят в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1—2 капли суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3—4-часовой инкубации при 37 "С.
Идентификацию культуры проводят на основании опреде-
Схема 13.3.1. Микробиологическое исследование при холере
ления чувствительности вибрионов к холерному фагу, агглю-тинабельности противохолерной 01-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и Огава, их гемолитических и биохимических свойств (оксидазная активность декарбоксилазы аминокислот, ферментация углеводов, образование ацетилметилкарбинола и др.).
Реакция Фогеса —Проскауэра: вибрионы выращивают в глюкозофосфатном бульоне, затем добавляют реактив аль-
фа-нафтол в растворе щелочи; при наличии ацетилметилкарбинола наблюдается рубиново-красное окрашивание среды.
Гексаминовый тест: культуру выращивают на бульоне с глюкозой, гексамином (уротропином) и индикатором бромти-моловым синим. В положительном случае через 6—8 ч наблюдается изменение зеленого цвета среды в желтый.
Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавливают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных вибрионов в реакции агглютинации с 01-сывороткой, по чувствительности к специфическому фагу и другими тестами; 3) определяют видовые признаки культур. Окончательное заключение о вьщелении и дифференцировании холерных вибрионов дают через 36—48 ч на основании комплексного изучения основных биологических признаков возбудителя (табл. 13.3.1).
Таблица 13.3.1. Тесты для дифференциации V.cholerae
| Тест | V.cholerae asiatici | V.cholerae el-tor | Неагглюти- нирующиеся вибрионы |
| + + |
Агглютинация О-сывороткой +
Агглютинация типовыми сы- +
| + + + + + + + |
воротками Огава и Инаба Лизис фагами:
| + + + + + + |
холерный фаг С (фаг IV) +
фаг Эль-Тор II —
Агглютинация куриных эрит- —
роцитов
Гемолиз эритроцитов барана —
Рост на агаре с 50 ЕД поли- —
миксина
Гексаминовый тест —
Реакция Фогеса—Проскауэра —
(образование ацетилметилкарбинола)
Трудности при оценке результатов бактериологического исследования встречаются при выделении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не агглютинирующихся холерной 01-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут лизиро-ваться одним из специфических холерных фагов и обладать другими свойствами, сходными с холерными вибрионами.
Экспресс-методы диагностики: иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной 01-сыворот-
кой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты "раздавленная" капля, которые исследуют с помощью темнопольной и фазо-во-контрастной микроскопии. В положительном случае через 3—5 мин движение вибрионов прекращается.
Иммунохимические исследования. Применяют метод прямой ИФ. Мазки из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 106 клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное подращивание материала на питательных средах.
Биохимические и молекулярно-биологические исследования. Исследуемый материал, полученный из очага инфекции, используют для обнаружения ДНК возбудителя с помощью ПЦР. В случае обнаружения соответствующих молекул можно поставить предварительный диагноз.
Серодиагностика. Выявление антител к возбудителю является вспомогательным и применяется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибрионосителей и оценки напряженности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РИГА, диагностический титр антител в этих реакциях 1:80—1:320, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса.
• Диагностика носительства
Во время вспышки холеры проводят массовое обследование на носительство V.cholerae.
МАТЕРИАЛ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ: ректальные мазки (фекалии, взятые тампоном из прямой кишки).
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ:
Бактериологическое исследование. Посев материала от 10 обследуемых на обогатительную среду с 01-агглютинирующей диагностической сывороткой. В положительных случаях через 3—4 ч начинается выпадение хлопьев в результате агглютинации размножившихся вибрионов. При обнаружении в осадке грамотрицательных подвижных вибрионов каждый из 10 пациентов обследуется индивидуально.
