Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


√енетическа€ модификаци€ дрожжей




ѕрименение методов генной инженерии позвол€ет дл€ оптимизации штаммов дрожжей использовать нар€ду с селекцией и мутацией так называемое рекомбинирование. ѕри мутации возможно изменение лишь отдельных генов, а при рекомбинировании удаетс€ соединить гены различных микроорганизмов. ѕри этом образуютс€ гибриды, у которых по сравнению с исходными штаммами наблюдаетс€ улучшение или дополнение некоторых свойств: усиление бродильных свойств, изменение хлопьеобразующих свойств, возможность сбраживани€ более широкого спектра сахаров (в частности декстринов), сбраживание редуцированных сахаров (например, дл€ слабоалкогольного пива), снижение образовани€ или ускоренное расщепление диацетила, устойчивость к токсинам дрожжей-киллеров.  роме того, в дрожжи могут быть внедрены дополнительные активные ферменты (эндо-β-глюканаза, амилаза, ами-логлюкозидазы и т. д.). ѕолучение гибридов дрожжей может проходить через рамножение (споры) или через неполовой цикл.

—крещивание путем размножени€ возможно у дрожжей лишь относительно, так как с учетом их полиплоидии (см. выше) и св€занной с этим пониженной склонности к образованию аскоспор они практически не формируют клеток с выраженными типами спаривани€. Ћишь благодар€ мутаци€м в гене, отвечающем за тип спаривани€, можно получить как Ђисключениеї вегетативные клетки пивоваренных дрожжей, способные к спариванию, после чего их можно скрестить с клетками противоположного типа спаривани€. »менно на этом основана технологи€ Ђредкого спаривани€ї. Ќапротив, неполовой цикл представл€ет собой соединение вегетативных клеток или протопласт. ƒругой возможностью €вл€етс€ трансформаци€ - внесение генетической информации в материнскую клетку. ѕрименение неполового (соматического) цикла или трансформации позвол€ет комбинировать наследственную информацию даже различных видов или родов микроорганизмов (в цикле размножени€ така€ возможность отсутствует).

ѕротопластами €вл€ютс€ клетки, стенки которых имеют такой состав ферментов, который обеспечивает их осмотическую лабильность. ¬ гипотонических растворах они разрываютс€, а в гипертонических растворах сохран€ют некоторое врем€ жизнеспособность, принима€ шарообразную форму. –егенераци€ стенки клетки происходит путем введени€ протопластов в гипертонический питательный агар.  летка, ставша€ после этого вновь полноценной, может вновь размножатьс€ путем почковани€. ¬ определенных услови€х протопласты способны независимо от их типа спаривани€ и видовой принадлежности снова сливатьс€ друг с другом. ѕутем сли€ни€ протопластов можно осуществл€ть скрещивание пивоваренных дрожжей, в том числе пивоваренных дрожжей с дрожжами-киллерами.

ƒрожжи-киллеры выдел€ют токсин, который при содержании дрожжей-киллеров в попул€ции культурных дрожжей в 1-2% способен подавить жизнеде€тельность культурных дрожжей. ’от€ такие дрожжи-киллеры не прекращают процесс брожени€, пиво приобретает посторонний привкус (например, фенольный - см. раздел 7.4.3.3).

ќсобенно заметно про€вл€етс€ вредное действие дрожжей-киллеров в непрерывных системах брожени€. ¬ насто€щее врем€ отсутствуют достоверные сведени€ о том, в какой степени при нормальном брожении на пивоваренном производстве дрожжи-киллеры способны инфицировать сусло или нарушать ход процесса брожени€.

«а выработку дрожжами-киллерами токсина (а следовательно, и за сопротивл€емость к нему) отвечают гены, расположенные не в хромосомах €дра клетки, а в так называемой плазмиде-киллере. Ёта плазмида €вл€етс€ молекулой –Ќ  с двойной спиралью, упакованной в белковую оболочку и присутствующей в 10-12 копи€х за пределами €дра клетки в цитоплазме дрожжей-киллеров. “ак как гены, отвечающие за поведение дрожжей, расположены на хромосомах €дра клетки (как и гены, которые делают дрожжи-убийцы неприемлемыми в качестве пивоваренных дрожжей, например, из-за образовани€ постороннего привкуса, пониженной способности к брожению, неблагопри€тных хлопьеобразующих свойств), то скрещивание пивоваренных дрожжей с дрожжами-киллерами следует проводить только до стадии сли€ни€ цитоплазм (плазмогамии), но не сли€ни€ €дер (кариогамии). “аким образом, происходит замена только цитоплазматических генов, но не хромосомных. ѕодобные гибриды в отличие от гибридов с плазмогамией и кариогамией, имеют €дро одного из Ђродителейї с цитоплазмой, содержащей плазмиды обоих Ђродителейї. ” гибридов с €дром клетки пивоваренных дрожжей речь идет о Ђжелаемыхї пивоваренных дрожжах-киллерах. ƒрожжи с €дром дрожжей-киллеров можно обнаружить и выделить с помощью маркеров. ѕолученные таким способом Ђпивоваренные дрожжи-киллерыї обладают свойствами пивоваренных дрожжей, однако при брожении они выдел€ют активный токсин, служащий защитой против контаминации дрожжами-киллерами. ƒрожжи-киллеры (и тем самым пивоваренные дрожжи-киллеры) невосприимчивы к некоторым токсинам отдельных рас дрожжей, например к K1.

¬ ходе протопластического сли€ни€ или трансформации могут вводитьс€ чужеродные гены - например, β-1,4-глюка-назы из гифомицет. Ёндо-ß-1,3- и 1,4-глю-каназы от Bacillus subtilis внос€т в пивоваренные дрожжи верхового и низового брожени€. ѕри этом бродильна€ способность дрожжей не мен€етс€, а устойчивость гена ß-глюканазы в дрожжах дл€ низового брожени€ оказываетс€ лучше, чем в дрожжах дл€ верхового брожени€, в частности, дл€ производства эл€.

ќбразование 2-ацетолактата или 2-ацетогидроксибутирата может быть снижено путем редуцировани€ синтеазы ацетогидроксикислот (прерывани€ областей кодировани€). ѕовышение активности редуцирующих изомераз и дегид-ратаз может инициировать усиленный приток ацетогидроксикислот к валину или лейцину.

Ќа этих примерах мы хотели показать результаты, уже достигнутые генной инженерией, и показать, каких результатов можно ожидать в ближайшем будущем. ƒо сих пор открытым остаетс€ вопрос, не окажут ли эти модификации долговременного воздействи€ на общее поведение дрожжей, а также вопрос о продолжительности сохранени€ свойств, внесенных плазмидами. ¬ случае пивоваренных дрожжжей-киллеров проблем в этом отношении пока не вы€влено.

јвтолиз дрожжей

јвтолиз дрожжей происходит при неправильном их хранении, а также при определенных услови€х в ходе брожени€ и хранени€ пива. ‘ерменты дрожжей расщепл€ют углеводы клетки и азотистые вещества, разруша€ структуру дрожжевой клетки, а вакуоли увеличиваютс€ за счет цитоплазмы. —убстрат насыщаетс€ аминокислотами и другими продуктами расщеплени€ белка, особенно нуклеотидами; значение pH возрастает, особенно вследствие выделени€ щелочных аминокислот и св€зывани€ ионов водорода продуцируемыми фосфатами и протеинами.  роме того, происходит выделение среднемолекул€рных жирных кислот (C6-C12) » »’ —Ћќ∆Ќџ’ эфиров, а также протеаз дрожжей и других ферментов. ѕервые расщепл€ют высокомолекул€рные белковые вещества с увеличением содержани€ α-аминного азота, что негативно отражаетс€ на пенообразующих свойствах пива. Ёти €влени€, происход€щие в конце процесса брожени€, при дображивании (особенно при повышенных температурах), а также при длительном холодильном хранении сусла с высоким содержанием дрожжей, €вл€ютс€ лишь начальной стадией автолиза, котора€ органолептически про€вл€етс€ в по€влении резкого вкуса, отчасти напоминающего Ђстарые дрожжиї. —ильный автолиз дрожжей может вызывать по€вление в пиве даже привкуса креозота (см. раздел 7.4.3.3).

ћетаболизм дрожжей

 ак и в любом живом организме, в дрожжах происходит регул€рный обмен веществ. ¬ ходе протекающих при этом реакций энерги€ выдел€етс€ и потребл€етс€, причем эти процессы взаимосв€заны. ¬ клетке происходит накопление резервных веществ, которые при необходимости могут быть использованы. ¬ процессе распада и синтеза веществ образуетс€ множество промежуточных продуктов реакций и новых веществ. ѕри отсутствии необходимых дрожжам веществ они могут синтезировать их из других соединений. ¬ зависимости от степени необходимости такого синтеза различаетс€ также количество различных продуктов обмена веществ в субстрате. “аким образом, нар€ду с этиловым спиртом и углекислым газом, составл€ющими основную долю продуктов брожени€, образуетс€ также большое число побочных продуктов, имеющих большое значение дл€ качества пива.

ƒл€ процессов метаболизма клетке необходима энерги€, однако используетс€ не энерги€, отдаваема€ в процессе брожени€ в виде тепла, а лишь химическа€ энерги€ соединений клетки. ¬ажнейшими из них €вл€ютс€ аденозиндифосфат (јƒ‘) и аденозинтрифосфат (ј“‘), служащие своего рода аккумул€торами и передатчиками энергии. »з 2870 кƒж (686 ккал), образующихс€ при сжигании одной молекулы глюкозы, при дыхании химически св€зываетс€ около 40 % (1110 кƒж или 266 ккал), тогда как при брожении затраты энергии несопоставимо меньше (80 кƒж или 19 ккал).

ћетаболизм углеводов

¬ пивном сусле из пригодных дл€ утилизации дрожжами углеводов присутствуют гексозы - глюкоза и фруктоза, дисахариды сахароза и мальтоза, а также трисахарид мальтотриоза.

Ќизкомолекул€рные и высокомолекул€рные декстрины дрожжами не потребл€ютс€. √люкоза и фруктоза диффундируют через клеточную стенку и преобразуютс€ внутри дрожжевой клетки по механизму, который мы рассмотрим ниже. —ахароза расщепл€етс€ инвертазой в области клеточной стенки до глюкозы и фруктозы. ћальтозе же и мальтотриозе, чтобы попасть внутрь клетки, где они гид-ролизируютс€ мальтазой до глюкозы, требуетс€ специальна€ транспортна€ система

с использованием ферментов мальтосе-пермеазы и мальтотриосепермеазы. ≈сли дрожжи адаптированы к мальтозе и мальтотриозе (как, например, в конце главного брожени€, когда дрожжи сразу же вновь внос€тс€ в следующую порцию сусла), утилизаци€ этих разных видов —ахаров дрожжами затем идет примерно параллельно. ≈сли до повторного внесени€ дрожжи хран€тс€ под водой, то адаптаци€ к мальтозе утрачиваетс€, и дрожжи сбраживают сахара в описанной выше последовательности.

–асщепление глюкозы в анаэробной среде до спирта и CO2 или аэробным путем - до CO2 и воды происходит следующим образом (мы приводим упрощенный вариант), причем до образовани€ пировиноградной кислоты (фаза 9) пути спиртового брожени€ и дыхани€ протекают параллельно.

3.2.1.1. —хема спиртового брожени€ по Ёмбдену-ћейергофу-ѕарнасу (Embden-Meyerhof- Parnas):

1. √люкоза переводитс€ гексокпназой в гликозо-6-фосфат. ¬ качестве донора фосфата выступает ј“‘, который превращаетс€ при этом в менее богатый энергией јƒ‘.

2. ¬ следующей фазе под действием фермента фосфогексозоизомеразы происходит перегруппировка во фруктозо-6-фосфат.

3. ¬ результате дальнейшего фосфорилировани€ под действием фосфофруктокиназы и ј“‘ (в качестве –-донора) нар€ду с јƒ‘ образуетс€ фруктозо-1,6-дифосфат.

4. «атем фруктозо-1,6-дифосфат расщепл€етс€ альдолазой на два изомерных трифосфата - глицераль-3-фос-фат и глицерон-3-фосфат, которые наход€тс€ в обратимом равновесии (1: 22) и катализируютс€ триозофосфатизомеразой.

5. ¬ дальнейшем происходит превращение глицераль-3-фосфата, который восстанавливаетс€ ферментом глицеральдегидро-3-фосфат-дегидро-геназы в две молекулы 1,3-дифос-фоглицерата. ѕри этом в св€зь встраиваетс€ неорганический фосфат. ƒл€ высвободившегос€ водорода акцептором служит Ќјƒ+ (никотинамид-аденин-динуклеотид).

6. ¬ дальнейшем фосфоглицераткиназа вызывает передачу фосфата гидроксильной группы и образуетс€ 3-фос-фоглицерат, причем јƒ‘ переходит в ј“‘.

7. ѕод действием фосфоглицератмутазы происходит перегруппировка фосфата и образуетс€ 2-фосфоглицерат.

8. Ёнолаза катализирует переход к фосфоенолпирувату.

9. ѕируваткиназа переводит две молекулы фосфоенолпирувата в две молекулы пирувата, и јƒ‘ снова преобразуетс€ в ј“‘. √лицерон-3-фосфат (фаза 4) может быть преобразован в глицеральдегид-3-фосфат (ферментом триозофосфатизомеразой), а затем также пройти фазы от 5 до 9. ѕроисходит разделение хода реакции анаэробного и аэробного гликолиза. √ликолиз продолжаетс€ по анаэробному пути.

10. ѕод действием пируватдекарбоксилазы происходит необратимое декарбо-ксилирование карбоксильной группы пирувата в ацетальдегид с высвобождением —ќ2.

11.  атализированный алкогольдегидрогеназой ацетальдегид редуцируетс€ до этилового спирта. ƒонором водорода здесь служит Ќјƒ H2 (из 5 фазы цикла).

3.2.1.2. ƒыхание.  ак мы уже отмечали, аэробный обмен веществ до фазы 9 протекает параллельно анаэробному. ≈сли на этой стадии присутствует кислород, то дальнейшее расщепление протекает по циклу лимонной кислоты (циклу  ребса): 10а) ѕируват коферментом A (CoA) переводитс€ сложным способом через отщепление CO2 в ацетил-—ој - активированную уксусную кислоту. ѕри этом Ќјƒ+ восстанавливаетс€ в Ќјƒ H2. 11а) — помощью оксалацетата ацетильна€ группа активированной уксусной кислоты превращаетс€ в лимонную кислоту.

12. ѕод действием аконитгидратазы через цисаконитовую кислоту в две стадии образуетс€ изолимонна€ кислота.

13. »зоцитрат-дегидрогеназа катализирует при участии Ќјƒ+ или Ќјƒ P+ (никотинамид-аденин-динуклеотидфосфата) дегидратацию в оксалосук-цинат (щавелево-€нтарную кислоту).

14. Ѕлагодар€ той же дегидрогеназе щавелево-€нтарна€ кислота декарбоксилируетс€ в 2-оксоглутарат (а-кетоглутаровую кислоту) с высвобождением CO2.

15. Ѕлагодар€ комплексу из трех ферментов (а-кетоглутарат-декарбоксиназа, липоилредуктаза-транссукцинилаза и дегидролипоил-дегидрогеназа) происходит окислительное декарбо-ксилирование до €нтарной кислоты. ѕри этом благодар€ коферменту ј в качестве промежуточного продукта образуетс€ сукцинилкој.

16. янтарна€ кислота дегидрируетс€ дегидрогеназой €нтарной кислоты до фумаровой кислоты.

17. Ѕлагодар€ присоединению воды фумараза (фумаратгидратаза) способствует образованию €блочной кислоты.

18. ÷икл завершаетс€ дегидрированием €блочной кислоты (малатдегидроге-назы) в щавелево-уксусную кислоту и повтор€етс€ с окислительным расщеплением ацетильной группы. Ёнергетический баланс цикла лимонной кислоты (обратимого) сбалансирован. ќтщепл€емые атомы водорода окисл€ютс€ кислородом воздуха до воды. ѕри этом вновь образуютс€ богатые энергией фосфатные св€зи (ј“‘), обеспечивающие этот круговорот или другие процессы. »з каждой молекулы глюкозы, котора€ окислительным путем расщепл€етс€ на CO2 и H2O, образуетс€ 38 молекул ј“‘. ѕри анаэробном расщеплении по пути спиртового брожени€ расходуетс€ всего 2 молекулы ј“‘ на 1 моль глюкозы.

ѕомимо приведенной выше схемы известен еще один способ расщеплени€ глюкозы.

3.2.1.3. ѕентозо- или гексозо-монофос-фатный цикл. ¬ этом цикле расщепление глюкозы до CO2 осуществл€етс€ путем пр€мого окислени€. Ёто происходит за счет окислительного декарбоксилировани€ глюкозо-6-фосфата в рибулозо-5-фосфат, причем редуцируютс€ две молекулы трифосфоридиннуклеотида (Ќјƒ –), которые затем окисл€ютс€ кислородом при дыхании. ¬ результате могут образовыватьс€ богатые энергией фосфатные св€зи. ¬ конечном итоге из трех пентозо-фосфатов возникают 2 гексозы (фрукто-зо-6-фостат и глюкозо-6-фосфат) и одна триоза. √ексозы затем могут быть снова подвергнуты пр€мому глюкозному окислению.

ѕосле многократного повторени€ этого цикла глюкоза может полностью окислитьс€. ¬ анаэробных услови€х этим путем расщепл€етс€ лишь 10 % глюкозы, а в аэробных дрожжах по пентозофос-фатному циклу метаболизируютс€ 26 %.

 ак и в схеме Ёмбдена-ћейергофа-ѕарнаса, так и в пентозо-фосфатном цикле отдельные промежуточные продукты реакций имеют большое значение в жизнеде€тельности дрожжей дл€ обмена Ђстроительными материаламиї. “ак, дрожжи идут по этому пути, если дл€ синтеза нуклеиновых кислот требуетс€ пентозо-фосфат или редуцированный Ќјƒ–.

ƒрожжи обладают способностью приспособить обмен веществ как к анаэробным, так и к аэробным услови€м. ’от€ первый вариант €вл€етс€ более предпочтительным, при наличии кислорода брожение сильно замедл€етс€ или совсем прекращаетс€, так как кислород расходуетс€ на дыхание (эффект ѕастера). “ак как при брожении дл€ метаболизма отсутствует необходимость в дыхательных ферментах, то дрожжи вырабатывают их только через мембранную систему метохондрий.

¬ аэробных культурах дрожжей, наоборот, небольша€ часть глюкозы сбраживаетс€ в спирт и CO2. ¬ысокое содержание глюкозы замедл€ет работу дыхательного ферментного комплекса, и брожение происходит вместе с дыханием (эффект  ребтри).

ѕри обычном брожении в пивоварении сбраживаетс€ примерно 98 % —ахаров, и на дыхание расходуютс€ лишь 2 %.

3.2.1.4. —интез углеводов, в частности гликогена, осуществл€етс€ под действием трансглюкозидаз и фосфорилаз. ѕри этом дрожжи образуют резервные углеводы (гликоген и трегалозу) только в анаэробной фазе, то есть после завершени€ размножени€ дрожжей. ќбразование гликогена соответствует примерно 0,25 % потреблени€ мальтозы.

 оличество гликогена как резервного углевода в первые 2 ч брожени€ снижаетс€ с 40 % (в пересчете на CB) до 20 % (см. раздел 3.1.2.2). Ќар€ду с этим дрожжи вырабатывают маннан и глюкан, необходимые дл€ образовани€ клеточных стенок.





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2015-11-23; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 2098 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

—вобода ничего не стоит, если она не включает в себ€ свободу ошибатьс€. © ћахатма √анди
==> читать все изречени€...

326 - | 299 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.024 с.