3.3.2.1. Закладка чистой культуры начинается с одной единственной дрожжевой клетки в форме капельной культуры или чашечным методом. Для изоляции одной клетки используют микроманипулятор. Из выбранной культуры дрожжей всегда целесообразно изолировать большее количество клеток и отобрать из них лучшие, что гарантирует разведение дрожжей с желаемыми свойствами. Основанием для выбора дрожжей является контроль их размножения, скорости и степени сбраживания, их осветление и, наконец, вкус пробы сусла, сброженного при пониженных температурах.
3.3.2.2. Разведение чистой культуры дрожжей на производстве осуществляется путем открытого разведения или путем закрытого выращивания. При открытом разведении чистая культура дрожжей, взятая, например, со среза культуры на агаре, засевается в 200 мл стерильного сусла (горячее охмеленное сусло, охлажденное до температуры около 12 °С) и доводится при комнатной температуре до стадии завитков, после чего сусло добавляется до 800 мл; в стадии высоких завитков вновь добавляют сусло до 5 л. После переноса в колбу Ганзена через 24 ч получается 25 л, которые добавляют в цилиндрический или цилиндроконический танк для размножения чистой культуры дрожжей (примерно к 25 гл сусла). При этом сусло перекачивают с использованием трубки Вентури при постоянной аэрации или проводят эту операцию периодически, а в промежутках сусло аэрируют с помощью аэрирующего месильного органа. В зависимости от засеянного количества клеток при температуре 13 °C через примерно 70 ч количество дрожжевых клеток возрастет примерно до 150 x 106. Степень сбраживания при этом составляет около 40-50 %. Отобранные 20-22 гл в стадии завитков затем вносят в 400-500 гл сусла с температурой 10-11 °С, причем опять-таки для получения степени сбраживания 40% требуется аэрация (через каждые 5 мин сначала в течение 60 с, а затем в течение 30 с). В этом танке количество дрожжевых клеток составляет около 100 млн, и их вносят в бродильный танк емкостью около 2000 гл сусла.
В танке емкостью 25 гл для разведения чистой культуры дрожжей остается примерно 2,5 гл завитков, в которые снова добавляют сусло и в более коротком цикле (36 ч) доводят количество клеток до 150-180 x 106. Этот процесс повторяют несколько раз. Сусло, предназначенное для этой операции, стерилизации не требует - важно, чтобы отбор в стадии завитков и повторное внесение семенных дрожжей проходили при степени сбраживания не более 45 %.
Непрерывное размножение чистой культуры дрожжей в стерильных условиях с использованием стерильного сусла позволяет осуществлять аппарат для выращивания чистой культуры дрожжей. Небольшое количество дрожжей, оставшееся в пропагаторе после брожения, служит для внесения дрожжей в следующую партию стерильного сусла. В течение 10-14 сут в зависимости от размера аппарата можно получить такое количество дрожжей, которое затем используется для дальнейшего размножения на производстве. Аппарат для выращивания чистой культуры дрожжей состоит из закрытого стерилизатора сусла и нескольких емкостей для размножения дрожжей. В стерилизаторе горячее охмеленное сусло еще раз стерилизуется, а затем охлаждается. После этого для первого засева оно подается отфильтрованным стерильным воздухом в емкость для размножения дрожжей, простерилизованную с помощью пара и охлажденную стерильным воздухом, в которой происходит засев чистой культурой дрожжей. После первого разведения к оставшемуся молодому пиву доливают только стерильное сусло (целесообразнее отобрать 20 гл исходного материала в стадии завитков и разбавить их примерно 100 гл сусла, обеспечив с помощью периодической аэрации соответствующее интенсивное размножение (до 100-120 млн дрожжевых клеток). Если процесс выращивания дрожжей продолжается слишком долго, то описанный выше способ разведения чистой культуры дрожжей является довольно рискованным (не говоря уже о недостаточной стерильности). Длительные анаэробные условия существования дрожжей, контакт с металлом, высокие температуры (порядка 12 °С) могут вызвать дегенерацию дрожжей, в связи с чем дрожжи необходимо менять не реже 1 раза в 3 мес.
Дегенерация дрожжей
О вырождении или дегенерации дрожжей говорят тогда, когда в дрожжах наблюдается негативное изменение их свойств. Признаками вырождения дрожжей являются вялое брожение, неудовлетворительный ход брожения, низкая степень сбраживания, замедленное, быстро прекращающееся дображивание, слишком низкое кислотообразование, небольшой выход дрожжей, образование ими студнеобразной массы и изменение хлопьеобразующих свойств. В большинстве случаев пиво, приготовленное с помощью таких дрожжей, обладает неприятным дрожжевым запахом и вкусом, а содержание диацетила в нем может быть повышенным или недостаточно снижаться при дображивании. Уже к концу брожения (самое позднее - при созревании) дрожжи выделяют щелочные аминокислоты, повышающие значение pH молодого пива; происходит также выделение средне молекулярных жирных кислот, которые при этерификации придают пиву дрожжевой привкус и ухудшают свойства пены. Последнее явление связано с выделением дрожжами протеаз, способных расщеплять белковые фракции, стимулирующие ценообразование. Хотя активность дрожжей благодаря их повторному доливу в стадии завитков можно несколько восстановить, рекомендуется, тем не менее, производить замену дрожжей по возможности быстро.
В связи с дегенерацией дрожжей даже в биологически безукоризненных условиях рекомендуется проводить смену дрожжей через 8-10 циклов их внесения. Дрожжи заменяют новой партией из аппарата для выращивания чистой культуры дрожжей, дрожжами, полученными путем открытого разведения или приобретенными на другом предприятии. Дегенерации дрожжей способствует целый ряд факторов - например, ненадлежащая обработка дрожжей, ошибки при внесении дрожжей или проведении брожения, а также неприемлемый состав и концентрация сусла.
Для дрожжей вредно слишком долгое пребывание дрожжевого осадка под давлением или при повышенных температурах, то есть слишком позднее их снятие, хранение в атмосфере CO2, продолжительное хранение (более одной недели) при температуре более 4 °С. Следствием неудовлетворительной аэрации при внесении дрожжей является недостаточное их размножение и ускоренное старение.
Высокие температуры брожения, как и слишком быстрое охлаждение дображиваемого пива, обусловливают быстрое «истощение» дрожжей. Продолжительное хранение дрожжей при повышенных температурах негативно сказывается на их свойствах. Слабо или неравномерно растворенный солод, способ затирания (недостаточное расщепление белков и крахмала), а также свойства пивоваренной воды (высокая остаточная щелочность, избыточная известковость при умягчении, высокое содержание нитратов), ошибки при кипячении сусла, при отделении осадка взвесей горячего сусла и в снабжении сусла кислородом также отрицательно сказываются на составе сусла. Дегенерацию дрожжей может стимулировать недостаток цинка в сусле (содержание менее 0,12-0,15 мг/л). Другие металлы, в частности железо и медь, токсичны для дрожжей. В очень жидком или очень концентрированном сусле образуются неблагоприятные условия для питания дрожжей и хода брожения, а содержание спирта более 5 % об. ингибирует жизнедеятельность дрожжей. Кроме того, для дрожжей токсичны некоторые продукты метаболизма других микроорганизмов.
Снятие дрожжей
В конце главного брожения дрожжи низового брожения постепенно оседают на дне бродильного чана. У хлопьевидных дрожжей отстой, в большинстве случаев, плотный, а у пылевидных - рыхлый. В осадке хлопьевидных дрожжей различают три слоя:
· верхний слой осадочных дрожжей - самый верхний, последний слой осевших дрожжей, в котором хотя и присутствуют активно бродящие клетки, но имеется и много примесей (хмелевые смолы, соединения дубильных веществ и коагулированные белки);
· семенные дрожжи - их, как правило, получают в виде маточных дрожжей; в них содержатся те дрожжевые клетки, с помощью которых осуществлялось главное брожение и которые затем выпали в осадок; эти дрожжи наиболее чисты в биологическом отношении и содержат меньше всего загрязнений;
· нижний слой осадочных дрожжей - самый нижний слой осевших дрожжей, в котором содержатся осадок взвесей и мертвые дрожжевые клетки; в нем также присутствуют активные дрожжевые клетки с большой удельной массой, выпавшие в осадок в начале брожения.
При снятии задаточных дрожжей для дальнейшего их внесения верхний слой осадочных дрожжей осторожно отделяют от слоя семенных дрожжей. Затем эти дрожжи извлекают и в конце удаляют нижний слой осадочных дрожжей. Такого рода отделение с увеличением размеров бродильных чанов все более затрудняется, а в горизонтальных бродильных танках оно вообще невозможно. В то же время цилиндроконические танки (ЦКТ) позволяют осуществлять точное удаление нижнего слоя осадочных дрожжей (например, путем заблаговременного «резкого слива» этих загрязнений). В чане для внесения дрожжей (емкость для седиментации взвесей охлажденного сусла, флотационный танк) все равно остаются частички взвесей и мертвые дрожжевые клетки, что хотя и позволяет получить чистую культуру дрожжей, но при этом уже невозможно отделить верхний слой осадочных дрожжей от семенных. Механические загрязнения удаляют путем процеживания, а также методами отстаивания или флотации дрожжей.
Пылевидные дрожжи зачастую в бродильном отделении вообще не осаждаются или осаждаются неудовлетворительно. Для получения достаточного количества задаточных дрожжей пылевидные дрожжи прежде зачастую собирали в промежуточные танки (см. раздел 3.6.2.1). В настоящее время для снятия дрожжей и для точного регулирования количества дрожжевых клеток для последующего дображивания применяют центрифуги для молодого пива.
Так как выход дрожжей в 3-4 раза превышает первоначальный объем, то, как правило, появляется избыток дрожжей, позволяющий после 5-8 циклов выводить дрожжи из производства. Избыточные дрожжи отделяют от пива при помощи прессов, центрифуг, декантеров или с использованием новых технологий фильтрования (см. раздел 4.4).
Очистка дрожжей
3.3.5.1. Большую часть загрязнений можно удалить путем фильтрования (лучше всего с помощью вибросит с ситами из нержавеющей стали со средним размером отверстий 0,4-0,5 мм). Если дрожжи необходимо сразу же заново вносить (технология «из бидона в бидон»), то при их получении рекомендуется оставлять немного больше пива, сохраняя консистенцию, пригодную для перекачивания насосом и процеживания. Если до следующего внесения дрожжи оставляют на 1-2 сут, их можно держать «под пивом»; при более длительном сроке хранения дрожжи следует промыть.
3.3.5.2. Промывка дрожжей способствует удалению механических загрязнений, мертвых дрожжевых клеток и сохранившихся бактерий. Для промывки чаще всего используют охлажденную (до 4-5 °С), биологически стерильную воду жесткостью 8-10 нем. градусов жесткости. Очень жесткая вода оказывает на дрожжи неблагоприятное физиологическое действие, как и ионы нитратов, тогда как слабое хлорирование воды (0,5 г/м3) относительно безвредно.
Промывка дрожжей может проводиться:
· в чане для хранения дрожжей путем простого смешивания с холодной водой, периодически сливаемой после осаждения дрожжей и заменяемой свежей водой;
· в чанах для очистки дрожжей отмучиванием с нижним подводом воды, где удаление загрязнений происходит благодаря переливу воды; размещение сливов на различной высоте позволяет спускать воду с загрязнениями послойно вплоть до поверхности осевших дрожжей, которые перекачивают затем в чаны для хранения дрожжей;
· в воронках для очистки дрожжей отмучиванием, где дрожжи завихряются поступающей снизу водой (расширяющаяся кверху воронка обусловливает снижение скорости воды, так что дрожжи захватываются только до определенной высоты их слоя); очистка заканчивается через час, и после оседания дрожжей проводится их отделение от использованной для очистки воды (дрожжи выдавливаются из нижней части воронки давлением находящейся над ними воды);
· с помощью колец для очистки дрожжей отмучиванием, которые помещают в чаны для хранения дрожжей.
Промывка кислотой используется для очистки инфицированных дрожжей. На каждый литр густых дрожжей следует добавить такое количество 3 %-ной фосфорной кислоты, чтобы получить значение pH 2,0. Через 4-6 ч (целесообразна перекачка дрожжей насосом) кислота из дрожжей вымывается с помощью упомянутых выше воронок для очистки дрожжей отмучиванием или цилиндроконических танков. Промывка кислотой сильнее ослабляет дрожжи низового брожения, чем верхового, и в этом случае норму внесения дрожжей (по количеству клеток) следует увеличить.
В заключение необходимо отметить, что при условии хорошего осветления сусла и надлежащей технологии внесения дрожжей их очистка требуется несколько в меньшей степени, чем прежде, и дрожжевые сита из-за трудностей их включения в цикл очистки применяются все реже. Тем не менее при снятии дрожжей из ЦKT очистке дрожжей уделяется большое внимание, в частности, для их восстановления. При извлечении дрожжей из бродильных чанов, горизонтальных бродильных емкостей или танков с плоскоконическим днищем дрожжи бывают настолько загрязнены, что их очистка по-прежнему очень важна.
3.3.5.3. Удаление углекислого газа из засевных дрожжей важно, прежде всего, при использовании ЦКТб. Так как дрожжи извлекают из конусной части, на них действует давлением. Хранение дрожжей под давлением CO2 (возможно, вследствие недостаточной вместимости емкости для дрожжей) ухудшает жизнеспособность дрожжей и скорость брожения со всеми вытекающими отсюда негативными последствиями для свойств пива. Наиболее целесообразным приемом является снятие давления с помощью дрожжевого сита; при этом удаляется и большая часть CO2. При снятии дрожжей в закрытой системе рекомендуется применять танк для регенерации дрожжей с устройством для их перекачивания и аэрирующей форсункой (трубкой Вентури).
При перекачивании потоки дрожжей и воздуха можно направить таким образом, чтобы избежать сильного вспенивания дрожжей (при этом необходимо предусмотреть 100-150 % свободного пространства на подъем). Сусло, аэрированное таким способом, необходимо использовать для внесения дрожжей в течение последующих 24 ч.
Хранение дрожжей
На небольших предприятиях хранение дрожжей осуществляют в чанах для хранения дрожжей или дрожже растильных чанах, устанавливаемых в отдельном охлаждаемом помещении (отделении для хранения чистой культуры дрожжей). При обычном интервале между снятием и повторным внесением в 2-3 сут дрожжи рекомендуется хранить в охлаждаемых чанах для хранения дрожжей при температуре 0-2 °С. При объеме до 6 гл такие чаны оснащены рубашкой и могут опрокидываться; изготавливают их преимущественно из нержавеющей стали, реже - из алюминия, луженой меди или эмалированной стали. Более крупные емкости представляют собой чаны с системой охлаждения, выполненной в виде карманов достаточного размера; днище в чанах имеет уклон 10 %.
Для хранения дрожжей из бродильных танков и для автоматического их дозирования используют дрожжевые танки, которые представляют собой емкости из нержавеющей стали с коническим днищем (угол наклона стенок - 60°), оборудованные охлаждающими карманами, месильными органами и системой мойки. Измерение количества дрожжей осуществлялось прежде по измерительной планке, а в настоящее время с помощью датчиков объема. Во избежание коррозии следует учитывать содержание хлора в охлаждающей воде. Размер такой емкости выбирают под количество дрожжей, собираемых из бродильного чана - для бродильного чана вместимостью 300 гл необходим чан для хранения дрожжей с полезным объемом 12 гл. В ЦКТб при снятии давления с дрожжей в результате выделения углекислого газа происходит увеличение их объема, в связи с чем необходимо предусматривать дополнительное пространство (50-100 %) в зависимости от высоты ЦКТб. Общая вместимость всех чанов для хранения дрожжей должна соответствовать потребность в дрожжах в течение примерно 2 сут.
Слишком длительное хранение дрожжей под водой даже при низких температурах (0-2 °С) и приемлемом качестве воды не рекомендуется. В течение этого времени дрожжи утилизуируют запасы гликогена и выделяют в воду азотистые вещества, в результате чего дрожжи ослабевают и повреждаются. Снижение бродильной способности дрожжей проявляется, в первую очередь, в длительности забраживания (индукционная фаза). Хранение дрожжей под водой не должно длиться более 4-5 сут.
Кратковременное хранение дрожжей в течение 1-2 сут может осуществляться и в пиве, готовом к перекачке - это позволяет снизить потери пива при загустении дрожжей. Например, в случае двухнедельного перерыва целесообразно поместить дрожжи в сусло температурой 2 °С и оставить их там для медленного брожения. Еще одна возможность заключается в том, что дрожжи после тщательной промывки сильно отпрессовывают, помещают в металлические банки и хранят при температуре ниже 0 °С. Тем не менее наилучшим решением является внесение в несколько варок немного меньшего количества дрожжей и проведение брожения при более холодных температурах с расчетом получить пиво, готовое для перекачки на дображивание, через 10-14 сут. В этом случае дрожжи собирают, дегазируют, аэрируют и используют для внесения в партии после перерыва в варках. Увеличение продолжительности варок в стадии завитков и внесение семенных дрожжей доливом способствуют быстрому и сильному размножению дрожжей.
Перед повторным внесением дрожжей считается целесообразным интенсивно проаэрировать в течение 30-60 мин соответствующее количество дрожжей в дрожжевом танке при помощи указанного выше оборудования. Быстрому началу брожения содействует предварительное разбавление дрожжей суслом в отношении 1: 1 при интенсивном аэрировании.
Отгрузка дрожжей
На отгрузку сухие прессованные дрожжи (около 20 % CB) поступают в охлаждаемых контейнерах. Если контейнеры выполнены из полистирола, то дрожжи, завернутые в полимерную пленку и помещенные в металлические банки, благодаря охлаждению (например, с помощью пластиковых бутылок со льдом) можно хранить примерно в течение 1 нед. при температуре ниже 4 °С. Для длительной транспортировки без охлаждения дрожжи можно лиофилизировать, то есть высушить в замороженном состоянии, однако после такой обработки жизнеспособность сохраняет лишь незначительная часть дрожжевых клеток (около 10 %).
