Виявлення Listeria monocytogenes

у реакції наростання титру фага (РНФ)

Реакція наростання титру фага - швидкий специфічний метод виявлення лістерій, що забезпечує виявлення збудника в досліджуваному матеріалі без виділення культури і може бути використана як додатковий метод для виявлення L. monocytogenes у харчових продуктах (при проведенні протиепідемічних заходів і при епідрозслідуванні).

РНФ заснована на властивості індикаторного бактеріофага строго специфічно розмножуватися в клітинах гомологічного мікроба. Розмноження бактеріофага супроводжується збільшенням кількості його часток і підвищенням титру.

У реакції застосовують лістеріозні бактеріофаги L2A і L4A. Штами L.monocytogenes I (9-127) і II (9-72) серогруп. Поживні середовища з 0,5 % глюкози: 1,5 % МПБ, і 0,7 % МПА.

При постановці РНФ із пробами харчових продуктів зважують 25 г досліджуваного матеріалу, подрібнюють, поміщають у колбу ємністю 1 дм³ і додають 250 см³ МПБ. Суміш протягом 5-10 хв. струшують, потім 9 см³ переносять у бактеріологічну пробірку № 1 (дослід).

Бактеріофаги використовують у робочому розведенні (10 000 фагових корпускул у 1 см³). Для цього їх розчиняють у МПБ до вихідного об’єму, зазначеного на етикетці ампули, а потім на МПБ окремими піпетками роблять п'ять послідовних десятикратних розведень (в останньому розведенні титр бактеріофага складе 1 х 10⁴).

Суміш фагів готують шляхом змішування рівних об’ємів фагу L2A і L4A у робочому розведенні.

Для контролю титру бактеріофага, (ставлять один на групу аналізів), проведених одночасно, у пробірку № 2 (контроль) вносять 9 см³ МПБ.

У пробірки № 1 і 2 вносять по 1 см³ суміші фагів в робочому розведенні і витримують їх протягом 16-24 год. при кімнатній температурі, після чого в пробірки додають по 1 см³ хлороформу. Вміст ретельно струшують і залишають при кімнатній температурі на 30-40 хв. Хлороформ осідає на дно, надосадову рідину піддають подальшим дослідженням.

При використанні суміші фагів з дослідної і контрольної пробірок (№ 1 і 2) беруть по 0,2 см³ і переносять по 0,1 см³ у дві пробірки, що містять по 0,9 см³ МПБ (один ряд для виявлення фагу L2A, а другий - L4A), а потім з кожної пробірки готують ще одне десятикратне розведення.

Готують суспензії штамів I і II серогруп за стандартом мутності 10 од. шляхом розведення добової агарової культури у фізіологічному розчині. В усі пробірки з розведеним матеріалом додають по 0,1 см³ суспензії штаму 1 серогрупи для виявлення фагу L2A або штаму II серогрупи для виявлення фагу L4A.

Вміст пробірок засівають методом агарових шарів за Граціа. Для цього напередодні дня дослідження в чашки Петрі розливають по 10 см³ 1,5 % МПА; Якщо МПА розливають у день дослідження, то поверхню агару попередньо підсушують протягом 40-50 хв. при (37±1)⁰С або 2 год. при кімнатній температурі. Для другого шару використовують розплавлений і охолоджений до (48-50) °С 0,7% МПА, який варто використовувати протягом години, тому що пізніше він набуває желеподібної консистенції і непридатний для дослідження. У пробірки піпеткою вносять по 2,5-3 см³ розплавленого й охолодженого до 48-50 °С 0,7 % МПА. Вміст швидко і ретельно перемішують обертанням пробірки між долонями і виливають у чашку Петрі. Суміш легким погойдуванням чашки рівномірно розподіляють другим шаром на поверхні 1,5%-ного МПА. Чашки залишають на рівному місці на 20-30 хвилин (до застигання 0,7 % МПА), потім перевертають і інкубують при кімнатній температурі.

Облік реакції проводять через 16—24 год. інкубації посівів.

У дослідних пробах і контролі титру фага підраховують число негативних колоній у всіх чашках. Негативні колонії - округлі, добре помітні на тлі бактеріального росту, прозорі ділянки, що утворяться в результаті лізису бактерій.

При обліку результатів порівнюють кількість негативних колоній на чашках відповідних розведень.

Результати реакції оцінюють за збільшенням титру бактеріофага (кількості негативних колоній):

• збільшення кількості негативних колоній у пробі, що досліджується, відносно контролю в 5 і більше разів (хоча б по одному з розведень) оцінюється як позитивний результат, менше, ніж у 5 разів - негативний;

• суцільний лізис або лізис з острівцями оцінюється як позитивний результат.

При одержанні позитивного результату РНФ дають висновок, що в досліджуваному матеріалі (пробі) виявлені бактерії роду Listeria.

11. Визначення Listeria monocytogenes за допомогою автоматичного імуноаналізатора типу “miniVIDAS”

Дослідження проводять із застосуванням набору VIDAS Listeria monocytogenes ІІ (LMO 2). Для визначення Listeria monocytogenes слід дотримуватись інструкції виробника. Отримання позитивного результату свідчить про наявність у пробі патогенних лістерій. Позитивні результати, отримані експрес-методом потребують підтвердження бактеріологічним методом.