Основа агару МакБрайда для лістерій

/ Основа агару МакБрайда для лістерій модифікована –

McBride Listeria Agar Base / Modified McBride Listeria Agar Base (M386 / M891)

Середовище використовують для селективного виділення і культивування Listeria monocytogenes з клінічного матеріалу, від персоналу харчових об'єктів і ін.

Склад:	М386 грам/дм3	М891 грам/дм3
Гідролізат казеїну Пептичний перевар тваринної тканини Триптоза М'ясний екстракт Натрію хлорид Гліциновий ангідрид Літію хлорид Фенілетанол Агар-агар Кінцеве значення рН (при 250С) 7,3 ± 0,2	– – 10,00 3,00 5,00 10,00 0,50 2,50 15,00	5,00 5,00 – 3,00 5,00 10,00 0,50 2,50 15,00

Приготування. Розмішати 46,0 г порошку в 1000 см³ дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121⁰С) протягом 15 хв. Охолодити до температури нижче 50⁰С і перед застиганням асептично додати в середовище М386 стерильну дефібриновану кров (до кінцевої концентрації 5% об/об) і в обидва середовища розчинений в 10 см³ 0,2 N NaOH вміст 1 флакона з добавкою МакБрайда для лістерій (FD171). Ретельно перемішати і розлити в стерильні чашки Петрі. Середовище має світло-бурштинове забарвлення, прозоре або має легку опалесценцію.

Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну, триптоза, м'ясний екстракт, пептичний перевар тваринної тканини, м'ясний екстракт служать джерелом вуглецю, азоту, мінеральних речовин, вітамінів В, мікроелементів і інших важливих чинників для росту лістерій. Фенілетилалкоголь вибірково пригнічує синтез ДНК, має бактеріостатичну дію на грамнегативні бактерії. Гліцин пригнічує ріст деяких бактерій, включаючи Escherichia coli і Enterococcus faecalis. Хлорид літію також володіє антимікробною активністю.

Визначення Listeria monocytogenes істотно поліпшується при використанні одно- або двохетапного збагачення матеріалу на рідкому середовищі. Відповідно до одноетапного методу, інфікований матеріал засівають безпосередньо на Збагачувальний бульйон для лістерій. За двохетапним методом спочатку матеріал засівають в Триптозний бульйон (М177) і інкубують в холодильнику при 4⁰С протягом декількох тижнів для холодового збагачення (лістерії можуть розмножуватися при низьких температурах). Потім інокулюють Збагачувальний бульйон для лістерій і, далі, роблять висів на селективний агар, наприклад, модифікований агар МакБрайда. Підозрілі на лістерії колонії відбирають при відбитому (45⁰) освітленні. Колонії лістерій щільні білі або веселково-білі, мають вид битого скла. Дрібні колонії мають блакитний відтінок. Колонії інших мікроорганізмів жовто-оранжеві. Агар МакБрайда можна використовувати як основне середовище (з додаванням крові або без неї).

Основа селективного агару LPM для лістерій - LPM Agar Base (M1228)

Агар LPM (з літієм, фенілетанолом і моксалактамом) рекомендують для виділення і культивування Listeria monocytogenes з молочних і інших харчових продуктів.

Склад:	грам/дм3
Гідролізат казеїну Пептичний перевар тваринної тканини М'ясний екстракт Гліциновий ангідрид Літію хлорид Натрію хлорид Фенілетанол Агар-агар Кінцеве значення рН (при 250С) 7,3 ± 0,2	5,00 5,00 3,00 10,00 5,00 5,00 2,50 15,00

Приготування. Розмішати 50,5 г порошку в 1000 см³ дистильованої води. Підігріти до кипіння для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121⁰С) протягом 12 хв. Охолодити до 50⁰С і асептично додати добавку FD151. Ретельно перемішати і розлити в чашки Петрі. Готове середовище має жовте забарвлення, прозоре або з легкою опалесценцією.

Принцип і оцінка результату. Гідролізат казеїну, м'ясний екстракт і пептичний перевар тваринної тканини є джерелом необхідних поживних речовин для росту. Гліциновий ангідрид, хлорид літію і фенілетанол пригнічують ріст грампозитивних коків і грамнегативних паличок. Моксалактам пригнічує ріст грампозитивних і грамнегативних бактерій, включаючи стафілококи, протеї і псевдомонади. При косому освітленні колонії Listeria monocytogenes виглядають веселковими блакитно-зеленими.

 

Нітратний агар / Нітратний бульйон –

Nitrate Agar / Broth (M072 / M439)

Ці середовища рекомендують для визначення нітратредуктази у бактерій.

Склад:	М072 грам/дм3	М439 грам/дм3
Пептичний перевар тваринної тканини М'ясний екстракт Калію нітрат Агар-агар Кінцеве значення рН (при 250С)	5,00 3,00 1,00 12,00 6,8 ± 0,2	5,00 3,00 1,00 – 7,0 ± 0,2

Приготування. Розмішати 21,0 г порошку М072 або 9,0 г порошку М439 в 1000 см³ дистильованої води. Прокип'ятити для повного розчинення частинок. Розлити в пробірки. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121⁰С) протягом 15 хв. Охолодити пробірки з середовищем в нахиленому стані. Готове середовище має світло-бурштиновий колір, прозоре або з легкою опалесценцією.

Принцип і оцінка результату. Здатність відновлювати нітрат є варіабельною ознакою і може використовуватися для диференціації і ідентифікації бактерій, зокрема представників родини ентеробактерій. Неферментуючі бактерії і ряд інших грамнегативних паличок варіюють за здібністю до редукції нітратів. Деякі з них здатні до денітрифікації з відновленням нітрату до газоподібного азоту. Утворення азоту з нітрату є важливим диференціальним тестом для ферментуючих глюкозу грамнегативних бактерій. Відновлення нітрату звичайно відбувається в анаеробних умовах, коли мікроорганізми «відщеплюють» кисень з нітрату. Представники Enterobacteriaceae, зазвичай, відновлюють нітрат до нітриту, який реагує з сульфаніловою кислотою і N,N-диметил-1-нафтиламіном, внаслідок чого розвивається червоне забарвлення (реакція Гріса). Якщо мікроорганізм активно редукує нітрат, тест треба проводити раніше, поки утворений нітрит повністю не перейшов в газоподібний азот.

Приготування реактивів для нітратного тесту:

1. Сульфанілова кислота: розчинити 8,0 г сульфанілової кислоти в 1 дм³ 5N оцтової кислоти.

2. Альфа-Нафтиламіновий реактив: розчинити 5,0 г a–нафтиламіну в 1 дм³ 5N оцтової кислоти.

УВАГА: реактиви токсичні, вимагають обережного обігу; уникати піпетування ротом, утворення аерозолів, попадання реактивів на шкіру.

Проведення тесту: Внести декілька крапель кожного реактиву в пробірку з досліджуваною культурою. На відновлення нітрату указує поява червоного або рожевого кольору середовища. Як негативний контроль ставлять тест з незасіяним середовищем. За відсутності почервоніння середовища, в пробірку додають щіпку порошку цинку, щоб переконатися у присутності нітрату в середовищі. Цинк відновлює нітрат, що супроводжується появою червоного забарвлення (у присутності тест-реактиву). Слід мати на увазі, що внесення дуже великої кількості цинку може привести до хибнонегативної реакції. Нітратний тест не є вирішальним для ідентифікації. Остаточну ідентифікацію проводять з урахуванням морфологічних ознак, фарбування за Грамом, біохімічних і серологічних характеристик мікроорганізму.

Бульйон для визначення цукролітичної активності лістерій –

Carbogydrate Consumption Broth (М1264)

Рекомендується для культивування і диференціації різних видів лістерій.

Склад:	грам/дм3
Протеозопептон Натрію хлорид М'ясний екстракт Бромкрезоловий пурпуровий Кінцеве значення рН (при 250С) 6,8 ± 0,2	10,00 5,00 1,00 0,10

Приготування. Розмішати 16,1 г порошку в 990 см³ дистильованої води. Нагрівати, при необхідності, до повного розчинення компонентів середовища. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121⁰С) протягом 15 хв. Асептично додати 10 см³ стерильного розчину відповідного вуглеводу до кінцевої концентрації 0,5%. Добре перемішати і розлити у пробірки. Готове середовище має пурпуровий колір, прозоре, не має преципітату.

Принцип і оцінка результату. Бульйон для визначення цукролітичної активності використовується для культивування і диференціації лістерій різних видів. Відповідно до рекомендацій FDA і Комітету ISO, він має низьку концентрацію бромкрезолового пурпурного. Диференціація лістерій заснована на здатності ферментувати глюкозу, дульцит, рамнозу, рафінозу і саліцин.

Пептон і м'ясний екстракт є джерелами вуглецю і азоту, включаючи незамінні амінокислоти, вітаміни і мікроелементи, необхідні для метаболізму бактерій. Бромкрезоловий пурпуровий служить індикатором кислотності середовища і при її закисленні жовтіє.

Основа бульйону з бромкрезоловим пурпурним для лістерій –

Purple Broth Base (M284D)

Рекомендовано Комітетом ISO для вивчення ферментації цукрів чистими культурами Listeria.

Склад:	грам/дм3
Протеозопептон Яловичий екстракт Натрію хлорид Бромкрезоловий пурпуровий Кінцеве значення рН (при 250С) 6,8 ± 0,2	10,00 1,00 5,00 0,02

Приготування. Розмішати 16 г порошку в 1000 см³ дистильованої води. Додати 5-10 г певного вуглеводу і стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121°С) протягом 15 хв.

Можливий альтернативний спосіб приготування середовища: до 900 см³ основи бульйону додають 100 см³ 5-10% розчину вуглеводу.

При стерилізації вуглеводів автоклавуванням слід дотримуватися обережності, щоб не допустити гідролізу вуглеводів. Готове середовище має пурпурове забарвлення.

Принцип і оцінка результату: Індикатором ферментації вуглеводів служить бромкрезоловий пурпуровий, який при закисленні середовища забарвлює його в жовтий колір. Утворення газу констатують за появою пухирців в поплавцях.

В бульйон засівають добову чисту культуру лістерій і інкубують протягом 24-72 годин (до 7 днів, якщо буде потрібно) при 35°С. Концентрація вуглеводів, що рекомендується - 1%.

 

Основа кров'яного агару - Blood Agar Base (М073)

Склад:	грам/дм3
Настій яловичого серця Триптоза Натрію хлорид Агар-агар Кінцеве значення рН (при 250С)	500,00 10,00 5,00 15,00 7,3 ± 0,2

Приготування. Розмішати 40,0 г порошку в 1000 см³ дистильованої води. Прокип'ятити для повного розчинення частинок. Стерилізувати автоклавуванням при 1,1 атм (121⁰С) протягом 15 хв. Охолодити до 50⁰С і асептично внести до 5% стерильної дефібринованої крові. Ретельно перемішати і розлити середовище в чашки Петрі. Основа середовища має світло-бурштинове забарвлення, прозора або з легкою опалесценцією при затвердінні. Після додавання крові середовище повинне мати вишнево-червоний колір з легкою опалесценцією.

Принцип і оцінка результату. Це середовище з настоєм серця використовують як основу для приготування кров'яного агару для визначення гемолітичних реакцій. Основа високопоживна і може використовуватись без додавання крові як середовище загального призначення.