Изотонический раствор натрия хлорида. К 1 л дистиллированной воды добавляют 9 г натрия хлорида. Раствор фильтруют, устанавливают заданный рН и, если нужно, стерилизуют при температуре 120 °С в течение 30 мин.
Мясопептонный бульон (МПБ). К мясной воде прибавляют 1% пептона и 0,5 % х.ч. натрия хлорида, кипятят на слабом огне 10-15 мин для растворения веществ, устанавливают нужный кислотный показатель рН и снова кипятят 30-40 мин до выпадения осадка. Фильтруют, доливают до первоначального объема водой и стерилизуют 20 мин при температуре 120 °С.
Мясопептонный агар (МПА). К готовому бульону (до стерилизации или после нее) добавляют 2-3 % измельченного агар-агара и кипятят, помешивая, на слабом огне до; полного расплавления агара. МПА можно варить в автоклаве или аппарате Коха. Готовую среду, если нужно, осветляют, фильтруют и стерилизуют 20 мин при 120 °С. Полужидкий агар содержит 0,4-0,5 % агар-агара.
Питательный желатин. К готовому бульону прибавляют 10-15 % желатина, подогревают до его расплавления (не кипятят!), разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром.
Рецепты приготовления сложных сред. Среды с углеводами. К основному бульону или расплавленному агару прибавляют нужное количество (0,1-2 %) определенного углевода (например, глюкозы). После его растворения разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром. Поскольку углеводы частично разрушаются даже при таком режиме стерилизации, предпочтительнее 25-30 % раствор углеводов, стерилизованный через бактериальный фильтр, добавлять в нужном объеме с соблюдением асептики к стерильным основным средам. После контроля стерильности среда готова к употреблению.
Среды с кровью готовят из стерильных простых сред, добавляя в асептических условиях (лучше в боксе) от 3 до 30 % (обычно 5 %) стерильной дефибринированной крови. Агаровые среды перед этим растапливают и остужают до 45 °С. При нужной температуре должно быть терпимое ощущение горячего, но не ожога. После добавления крови, пока среда не застыла, содержимое сосуда тщательно перемешивают и разливают в чашки или пробирки.
Разлив агаровых сред в чашки Петри.
Среды перед разливом расплавляют на водяной бане и остужают до 45-50 °С. Обычно для чашки диаметром 9 см достаточно 15-20 мл среды (высота слоя 0,25-0,3 см). Если слой выше, на нем менее контрастно выглядят колонии. При очень тонком слое резко ограничено количество питательных веществ и влаги (среда быстро высыхает) – ухудшаются условия культивирования.
Разливают среды в стерильные чашки в асептических условиях. Чашки ставят крышкой вверх. Сосуд со средой берут в правую руку, держа его у огня. Левой рукой вынимают пробку, зажав ее мизинцем и ладонью. Обжигают горлышко сосуда и двумя пальцами левой руки слегка приоткрывают крышку. Вводят под нее горлышко флакона, не прикасаясь им к краю чашки. Наливая среду, следят, чтобы она равномерно распределилась по дну чашки. Если при разливе на поверхности среды образуются пузырьки воздуха, к ним до того, как среда застынет, подносят пламя спички или горелки – пузырьки лопнут. Затем чашку закрывают и дают среде застыть.
Когда посев производят в день разлива, среду необходимо подсушить. Для этого чашки в термостате осторожно открывают и устанавливают крышки и чашки открытой стороной вниз на 20-30 мин. Если посев производят на следующий день после разлива, чашки, не подсушивая, завертывают в ту же бумагу, в которой их стерилизовали, и помещают в холодильник.
Приготовление скошенного агара.
Пробирки с 4-5 мл стерильной расплавленной агаровой среды укладывают в наклонном положении (примерно под углом 20 °С) с таким расчетом, чтобы среда не заходила за 2/3 пробирки, иначе она может смочить пробку, После того как среда застынет, пробирки ставят вертикально — дают стечь конденсату. Лучше употреблять свежескошенный агар.
Вопросы для обсуждения.
1 Для культивирования каких организмов используют живые среды?
2 Какой компонент входит в большинство твердых культуральных сред?
3 Как проверяется стерильность приготовленной среды?
6 Как проверяются биологические (культуральные) свойства приготовленной среды?
7 Можно ли хранить приготовленные среды и каким образом?
8 Для каких исследований используются жидкие среды?
