Питательные среды для посева и роста микробов готовят в определенной последовательности:
– варка;
– установление оптимальной кислотности рН;
– осветление и фильтрация;
– разлив;
– стерилизация;
– контроль.
Варка.
Приготовление плотных сред – дело весьма простое: стоит только к любой из жидких органических сред, приготовленных в соответствии с рецептами, добавить 10% желатины (пока среда горячая) или 1,3-2 % агара.
Посуда для приготовления питательных сред не должна содержать посторонних веществ, например, щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла, или окислов железа, которые могут попасть в среду при варке ее в ржавых кастрюлях. Лучше всего пользоваться стеклянной, эмалированной или алюминиевой посудой. Большие количества среды (десятки и сотни литров) готовят в специальных варочных котлах или реакторах. Перед употреблением посуду необходимо тщательно вымыть, прополоскать и высушить. Новую стеклянную посуду предварительно кипятят 30 мин в 1-2 %-м растворе хлорводородной кислоты или погружают в этот раствор на ночь, после чего в течение часа полощут в проточной воде. (Посудой, предназначенной для приготовления сред, нельзя пользоваться в других целях, например, для хранения химических реактивов или дезинфицирующих растворов, – даже следы этих веществ могут помешать росту микроорганизмов.)
Исходным сырьем для приготовления большинства сред служат продукты животного или растительного происхождения: мясо и его заменители, молоко, яйца, картофель, соя, кукуруза, дрожжи и др.
Основные питательные бульоны для роста культуры готовят на мясной воде или на различных переварах, полученных при кислотном или ферментативном гидролизе исходного сырья. Бульоны из переваров в 5-10 раз экономичнее, чем из мясной воды. Среды на переварах богаче аминокислотами, следовательно, питательнее, и обладают большей буферностью, т.е. имеют более стабильную величину рН. Кроме того, препараты можно готовить из заменителей мяса (сгустков крови, плаценты, казеина и т.д.). Чаще используют панкреатический перевар Хоттингера, гидролизаты казеина или кормовых дрожжей. Из полуфабрикатов по определенным рецептам готовят необходимые среды.
Варят среды на открытом огне, водяной бане, в автоклаве или варочных котлах, подогреваемых паром.
Устанавливают кислотность рН сред ориентировочно с помощью индикаторных бумажек. Для точного определения рН используют потенциометр.
Разливают среды в пробирки (по 3-5 или 10 мл), флаконы, колбы, матрицы и бутылки не более чем на 2/3 емкости, так как при стерилизации могут намокнуть пробки и среды утратят стерильность. Среды, которые стерилизуют при температуре выше 100 °С, разливают в чистую сухую посуду. Среды, стерилизуемые при более низкой температуре, обязательно разливают в стерильную посуду.
Разливают среды с помощью воронки, на конец которой надета резиновая трубка с зажимом Мора. Для мерного разлива применяют мензурки, бюретки, дозаторы, шприцы-пипетки и т. п.
Посуду со средой обычно закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки. Важно, чтобы при разливе среда не смачивала края посуды, иначе к ним могут прилипнуть пробки. К каждому сосуду обязательно прикрепляют этикетку с названием среды и той ее приготовления.
Контроль готовых сред.
1 Для контроля стерильности среды ставят в термостат на 2 суток, после чего их просматривают. Если на средах не появятся признаки роста, их считают стерильными и передают для химического контроля несколько образцов каждой серии;
2 Химический контроль: окончательно устанавливают рН, содержание общего и аминного азота, пептона, хлоридов (их количество должно соответствовать указанному в рецепте). Химический контроль сред производят в химической лаборатории;
3 Для биологического контроля несколько образцов среды засевают специально подобранными культурами микроорганизмов, и по их росту судят о питательных (ростовых) свойствах среды. К готовой среде прилагают этикетку и паспорт, в котором указывают название и состав среды, результаты контроля и др.
Хранят среды при комнатной температуре в шкафах, желательно специально для них предназначенных. Некоторые среды, например, среды с кровью и витаминами, хранят в холодильнике.
