Цель работы: определить количество клеток микроорганизмов исследуемой культуры под микроскопом, используя камеру Горяева-Тома.
Материалы и оборудование: автоматическая пипетка с наконечниками, исследуемые культуры микроорганизмов (дрожжи) в жидкой питательной среде, спиртовки, микроскоп, камера Горяева-Тома.
Основные положения
Для подсчета клеток микроорганизмов под микроскопом используют счетные камеры, препараты фиксированных и окрашенных клеток. Эти методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема (как живых, так и мертвых).
Подсчет клеток в счетных камерах.
Метод используют для подсчета крупных объектов – дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и крупных бактерий. Для этого используют камеру Горяева-Тома: толстое предметное стекло, разделенное бороздками. Центральная часть стекла содержит выемку глубиной 0,1 мм, на дно которой нанесена сетка (рис.27).
Рисунок 27. Камера Горяева-Тома
Камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов, которую вносят капилляром или пипеткой. Углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом, и слегка прижимая, двигают покровное стекло в противоположные стороны. Камеру помещают на столик микроскопа. Число клеток подсчитывают с объективом 8× (10×, 40×). С иммерсионным объективом работать нельзя, т.к. его рабочее расстояние меньше толщины стекла камеры. Просчитывают клетки микробов в 10 больших или 16 малых квадратах, следуя по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата (рис.28). Подсчет клеток повторяют 3-5 раз, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее суспензией микроорганизмов, что обеспечивает точность подсчета.
Рисунок 28. Большой квадрат сетки Горяева (ограничен тремя линиями) состоит из 16 малых квадратов. Плюсом обозначены клетки, которые считают, минусом клетки, которые не учитывают при подсчете. Стрелками указано направление подсчета.
Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле:
где М – количество клеток в 1 мл суспензии (клеток/мл);
а – среднее количество клеток в квадрате;
h – высота камеры, мм (0,1 мм);
S – площадь квадрата сетки, мм2;
103 - коэффициент перевода (см3 в мм3);
n – коэффициент разведения исследуемой культуры (во сколько раз разбавили исследуемую культуру).
Размер малых делений клетки сетки составляют 0,05 мм, а больших – 0,2 мм.
Количество клеток в 1 мл не разбавленной культуры (клеток/мл):
Задания
1. Изучить устройство камеры Горяева.
2. Найти под микроскопом малые и большие квадраты.
3. Подсчитать количество клеток в 1 мл исследуемой культуры, используя камеру.
4. Сделать вывод по работе
Контрольные вопросы
1. Как устроена камера Горяева-Тома?
2. Преимущества и недостатки счетных камер.
3. Как правильно подсчитывать клетки с помощью камеры Горяева-Тома?
4. Что учитывают при выражении количества клеток в 1мл исследуемой суспензии культуры?
Литература
1. Белясова, Н.А. Микробиология [Электронный ресурс]: учебник/ Белясова Н.А.— Электрон. текстовые данные.— Минск: Вышэйшая школа, 2012.— 443 c.— Режим доступа: http://www.iprbookshop.ru/20229.— ЭБС «IPRbooks», по паролю
2. Березовская В.А., Белоусова И.Н., Клочкова Н.Г. Биология и микробиология: Учебно-методическое пособие (практикум). – Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2006. – 92 с.
3. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках: Учебник для вузов/ Н.С.Егоров; МГУ им. М. В. Ломоносова.-6-е изд., перераб. и доп.- М.: Изд-во Моск.ун-та: Наука, 2004.-528с
4. Емцев, В.Т. Микробиология: учебник для вузов/ В.Т.Емцев, Е.Н.Мишустин.-6-е изд.,испр.- М.: Дрофа, 2006.- 444с.
5. Зимоглядова Т. В. И др. Практикум по микробиологии: учебное пособие / Т. В. Зимоглядова, И. А. Карташева, О. Г. Шабалдас. – М.: Колос; Ставрополь: АГРУС, 2007 – 148с.
6. Лебедев, В.Н. Микробиология с основами вирусологии. Часть I. Основы общей вирусологии [Электронный ресурс]: методическое пособие для студентов биологических специальностей/ Лебедев В.Н.— Электрон. текстовые данные.— СПб.: Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена, 2014.— 62 c.— Режим доступа: http://www.iprbookshop.ru/22556.— ЭБС «IPRbooks», по паролю
7. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для высш. проф. образования: в 2 т. / под ред. В. В. Зверева, М. Н. Бойченко.— М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010
8. Методы общей и специальной микробиологии: Учебное пособие. /Е.В.Никитина, О.А. Решетник; Казан. гос. технол. ун-т. Казань, 2006, 124 с.
9. Оценка параметров роста микроорганизмов в условиях периодического и непрерывного культивирования: методические указания к выполнению лабораторной работы по курсу «Основы микробиологии и биотехнологии» для студентов специальности 280201.65 «Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов» / сост. Л. А. Гаретова, О. А. Кириенко. – Хабаровск: Изд-во Тихоокеан. гос. ун-та, 2010. – 16 с.
10. Петр С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / С. Дж. Петр. – М.: Издательство «Мир», 1978. - 330 c.
11. Поздеев, О.К. Медицинская микробиология: Учебник для мед.вузов/ О.К.Поздеев; под ред. В.И.Покровского.-М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005.-768с.
12. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для вузов/ А.И.Нетрусов [и др.]; под ред. А.И.Нетрусова. -М.: Академия, 2005.-608с.
13. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для вузов/ Е.З.Теппер, В.К.Шильникова, Г.И.Переверзева; Под ред.В.К. Шильниковой.-5-е изд., перераб.и доп. -М.: Дрофа, 2004.-256с.
