Цель работы: освоить технику приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, познакомиться с простыми и дифференцированными методами окраски препаратов.
Материалы и оборудование: культуры микроорганизмов, бактериологические петли, предметные стекла, генцианфиолетовый, раствор Люголя, спирт, фуксин, вода, лоток для окраски, спиртовки, микроскоп.
Основные положения
Фиксация - обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к предметному стеклу и лучше прокрашиваются. В целях безопасности фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами.
Изучение морфологии микроорганизмов в окрашенном состоянии наиболее распространенный и удобный метод в микробиологии, т.к.:
-позволяет изучить морфологические особенности микроорганизмов, найти различия между ними, а иногда и точно определить изучаемый объект;
-удобен в практической работе, т.к. значительно легче исследовать убитые микроорганизмы, чем живые;
- легко доступен благодаря простоте техники окрашивания.
Приготовление окрашенного препарата
Техника отбора чистых культур микроорганизмов
Отбор проб чистых культур бактерий и дрожжей, которые вырастают на поверхности плотной среды в виде мазеобразного налета или в жидкой среде ведут в следующей последовательности:
1) Убедиться, что у вас имеется все необходимое для работы.
2) Зажигают спиртовку.
3) Чашку с культурой (или пробирку) помещают в левую руку. Поверхность с налетом микроорганизмов должна быть обращена вверх и хорошо видна.
4) Петлю держат вертикально в пламени горелки и прокаливают докрасна, затем наклоняют и обжигают примыкающую к ней металлическую часть петледержателя.
5) Приоткрывают чашку Петри (открывают пробирку, для этого мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают к ладони наружную часть ватной пробки, вынимают ее из пробирки и держа в таком положении, не касаясь окружающих предметов, а края открытой пробки обжигают в пламени горелки).
6) Осторожно вводят стерильную петлю в приоткрытую чашку или пробирку с культурой и охлаждают ее о стенки пробирки или прикоснувшись к питательной среде, свободной от микроорганизмов. Затем, легким движением осторожно отбирают небольшое количество микробной массы с поверхности среды или каплю жидкости с клетками. Вынимая петлю из чашки или пробирки, следят за тем, чтобы отобранный материал не касался стенок, и петля не оказалась над пламенем горелки.
7) Закрывают чашку (или пробирку, для этого снова обжигают в пламени горелки край пробирки, затем, легким круговым движением, обжигают ватно-марлевую пробку и закрывают пробирку).
8) Чашку с культурой отодвигают в сторону (пробирку ставят в штатив), а извлеченный материал используют для приготовления препарата.
Приготовление мазка.
На середину чистого обезжиренного стекла (для обезжиривания стекол используют смесь эталона и серного эфира 1:1) наносят каплю воды. Для проверки чистоты стекла на его поверхность наносят каплю воды. При достаточном обезжиривании капля растекается равномерно и не собирается в выпуклые, медленно высыхающие пузырьки. Берут стекла пинцетом или аккуратно за грани. Прокаленной бактериологической петлей из пробирки (или чашки Петри) берут небольшое количество микробной массы и вносят каплю воды (п.1). Каплю с исследуемым материалом тщательно размазывают петлей по стеклу тонким слоем (только при этом условии препарат удобен для изучения) таким образом, чтобы препарат распределился на площади примерно 2-3 см2.
Бактериологическую петлю прожигают на пламени горелки для стерилизации. Далее мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки (сильное нагревание препарата может привести к коагуляции белков, искажающей структуру и форму клеток). Высушенный препарат фиксируют.
Фиксация мазка.
Ее проводят над пламенем горелки при исследовании форм клеток или при помощи химических соединений для изучения внутренней структуры клеток. В первом случае препарат 3-4 раза проводят нижней стороной через наиболее горячую часть пламени горелки (на границе светлой и темной его части). Во втором случае используют формалин (выдерживают несколько секунд), ацетон (5 мин), этиловый (10 - 15 мин) и метиловый (2-3 мин) спирт. Для этого фиксатор наливают на мазок или препарат погружают в фиксирующую жидкость на определенное время.
Цель фиксации:
- умертвить клетки микроорганизмов и сделать их безопасными (что особенно важно при работе с патогенными микроорганизмами);
- зафиксировать (закрепить) мазок на стекле (чтобы они не смывались при окрашивании);
- улучшить окрашивание, поскольку мертвые клетки лучше адсорбируют на своей поверхности различные красители.
Окрашивание препарата.
Механизм окраски микроорганизмов является физико-химическим процессом. Соединение микроба с краской, в большинстве случаев, является стойким и не поддается разрушению или простому вымыванию водой. Различные виды микроорганизмов по-разному реагируют с одними и теми же красителями, что свидетельствует о неодинаковом химическом составе их протоплазмы.
При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. Продолжительность окрашивания составляет 1-5 мин в зависимости от цели окрашивания и вида красителя. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
Способы окрашивания микроорганизмов делятся на простые и сложные (дифференцированные).
Простой метод окрашивания препарата.
Используют один вид красителя, например, метиленовый синий, фуксин генциан фиолетовый, в щелочных или карболовых (фенольных) растворах. При этом прокрашивается вся клетка. Метод позволяет быстро ознакомиться с общей морфологией микробов.
Дифференцированный метод окрашивания.
Метод основан на особенностях физико-химического строения клетки и применяется для детального изучения ее структуры, а также для дифференциации данного микроорганизма от других.
Используют несколько красителей, при этом отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями (окраска по Грамму, окраска спор и др.).
Классификация красителей:
1) основные и кислые (первые вступают в реакцию с веществами основной природы; вторые - кислотной; т.к. в белках есть и основные (-NH2) кислотные (-СООH) группы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями);
2) позитивные (окрашивают клетки микроорганизмов и другие объекты) и негативные (окрашивают пространство, окружающие клетки микроорганизмов, в результате клетки выглядят силуэтами на окрашенном фоне).
Для изучения внутреннего строения микробных клеток применяют специальные способы окраски - цитохимические методы исследования. Многие из этих методов используют с диагностической целью.
2. Окраска клеток микроорганизмов по Граму.
Метод основан на различии в химическом составе клеточных оболочек микробных клеток. Суть метода: в клетках одних видов микроорганизмов образуются нерастворимые в спирте соединение йода с основным красителем, а у других видов это соединение появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микроорганизмы первой группы - грамположительные; второй - грамотрицательные. Поэтому все бактерии по своему отношению к этому методу делятся на две группы: окрашиваются по Граму (грамположительные, грампозитивные) и неокрашиваются (грамотрицательные, грамнегативные). Данный признак является важным в диагностике бактерий, поэтому обязательно указывается в их характеристике.
2.1. Техника окраски:
1) приготовить мазок исследуемой культуры, высушить и зафиксировать над пламенем спиртовки;
2) окрасить в течение 1-2 мин раствором генциана фиолетового (основной краситель), краситель слить в лоток (препарат водой не промывают!);
3) нанести на мазок 1 каплю раствора Люголя (до полного почернения мазка - 1-2мин);
4) нанести каплю спирта на 15-20с, непрерывно покачивая стекло (при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки);
5) препарат промыть водой;
6) окрасить в течение 2-3мин фуксином (дополнительный краситель);
7) препарат промыть водой (краситель смывают слабой струей до обесцвечивания смывной воды, при этом стекло держат в наклонном положении над лотком), аккуратно промокнуть фильтровальной бумагой и исследовать под микроскопом с иммерсионной системой.
При микроскопировании грампозитивные микробы приобретают темно-фиолетовый цвет, а грамнегативные - окрашиваются в цвет дополнительного красителя - фуксина.
Задание:
1) приготовить и зафиксировать 3мазка: грамположительной, грамотрицательной и неизвестной культур;
2) провести окрашивание всех мазков по Граму;
3) определить отношение исследуемой неизвестной культуры к окраске по Граму;
4) зарисовать препараты с клетками в рабочей тетради;
5) сделать выводы по работе.
Контрольные вопросы
1. В чем заключается фиксация клеток в микроскопии?
2. Какие преимущества микроскопического изучения окрашенных препаратов микроорганизмов?
3. Перечислите этапы отбора чистых культур микроорганизмов и приготовления препарата для микроскопирования.
4. Какими способами можно зафиксировать клетки микроорганизмов?
5. Какие цели преследует фиксация?
6. Почему различные виды микроорганизмов по-разному реагируют с одним и тем же красителем?
7. Какие способы окрашивания микроорганизмов выделяют?
8. На какие группы делят красители?
9. На чем основан метод окраски по Граму? Как делят микроорганизмы в результате окраски по Граму?
10. Какие этапы выделяют при окраске по Граму? На что обращают особое внимание в этой технике?
Лабораторная работа № 6
