Определение количества клеток микроорганизмов высевом
На плотные питательные среды (метод Коха)
Цель работы: определить количество клеток микроорганизмов исследуемой культуры высевом на агаризованную среду LB, используя метод стандартных серийных разведений.
Материалы и оборудование: чашки Петри с плотной питательной средой LB, шпатель Дригальского, стерильные пробирки с физиологическим раствором, автоматическая пипетка с наконечниками, исследуемые культуры бактерий в жидкой питательной среде, спиртовки.
Основные положения
О росте микроорганизмов в естественных субстратах или в питательных средах судят по изменению количества их клеток или биомассы в единице объема. Методы определения этих показателей бывают:
- прямые (подсчет клеток под микроскопом и взвешивание биомассы);
- косвенные (основаны на измерении параметров, величина которых зависит от количества биомассы микроорганизмов - число выросших колоний, поглощение суспензией света, содержание белка и т.д.).
Определение числа клеток микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (ПС) – является косвенным методом. В отличие от подсчета клеток под микроскопом, он дает возможность определить только число жизнеспособных клеток в популяции. Сред, пригодных для роста всех микроорганизмов не существует, поэтому метод высева дает возможность определить лишь число микроорганизмов, способных расти на среде данного состава.
Метод применяют для определения численности жизнеспособных клеток в различных естественных субстратах и лабораторных культурах. В его основе лежит принцип Коха, согласно которому каждая колония является потомством одной клетки. Это позволяет на основании числа колоний, выросших после посева на плотную ПС определенного объема исследуемой суспензии, судить об исходном содержании в ней клеток. Результаты количественного метода выражают не в числе клеток, а в условных единицах – колониеобразующих единицах (КОЕ).
Определение числа клеток этим методом состоит из 3-х этапов:
Ø приготовление разведений;
Ø посев на плотную питательную среду;
Ø подсчет колоний.
Приготовление разведений
Численность популяции микроорганизмов обычно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физиологическом растворе. Целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, например 10. Для приготовления разведений физ. раствор разливают по 4,5 мл в стерильные пробирки. Затем 0,5 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой вносят в первую пробирку – это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивают и новой стерильной пипеткой отбирают 0,5 мл суспензии и переносят во вторую пробирку – второе разведение (10-2). Аналогично готовят все последующие разведения (рис.26). Степень разведения зависит от плотности исследуемой популяции микроорганизмов.
Посев
Посев поверхностным способом осуществляют в чашки Петри с агаризованной ПС. Для этого в чашку вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы, как правило, проводят из трех последних разведений, причем из каждого делают 2-4 параллельных высева. После посева чашки помещают в термостат крышками вниз.
При глубинном посеве точно измеренный объем исходной суспензии или разведения вносят в расплавленную и остуженную до 45-50 °С среду, тщательно перемешивают и немедленно выливают в чашку Петри.
Для определения количества клеток анаэробов чашки после посева помещают в анаэростат.
Рисунок 26. Приготовление разведений
Подсчет выросших колоний
Колонии микроорганизмов в зависимости от скорости роста подсчитывают через 1-15 суток инкубации. Подсчет проводят не открывая чашки, а для удобства каждую просчитанную колонию отмечают точкой на наружной стороне дна чашки. Лучшим разведением считается то, из которого при высева вырастает от 30 до 150 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то результаты не используют. Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения суммируют и определяют среднее число колоний.
Количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле:
где М – количество клеток в 1 мл (КОЕ/мл);
а – среднее число колоний, выросших после посева из данного разведения;
V – объем суспензии, взятый для посева, мл;
10n – коэффициент разведения (n- номер десятикратного разведения).
Задания
1. Разогреть и разлить стерильную питательную агаризованную среду LB в чашки Петри.
2. Методом стандартных серийных разведений приготовить серию разведений (6 пробирок) исследуемой суспензии бактерий.
3. Из 5-го и 6-го разведений сделать высев в двух повторностях на чашки Петри со средой LB.
4. Чашки Петри поместить в термостат крышками вниз для инкубации при температуре 28 и 37°С на 24 – 48 часов.
5. Произвести подсчет числа колоний и вычислить количество КОЕ в 1 мл исходной суспензии.
6. Результаты опыта занести в таблицу 8.
7. Сделать вывод по работе.
Таблица 8 – Результаты опыта определения КОЕ высевом на плотные питательные среды
Название культуры
