Цель работы: исследовать живые клетки микроорганизмов методами раздавленной и висячей капли.
Материалы и оборудование: пробирки (или чашки Петри) с культурами бактерий, микробиологические петли, предметные стекла, предметные стекла с лункой, покровные стекла, краситель нейтральный красный или метиленовый синий (0,0001%), микроскоп, спиртовки.
Основные положения
Исследование микроорганизмов в живом состоянии применяют для выявления их подвижности, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, определения запасных веществ в клетке.
Изучение микробов проводят в неокрашенном состоянии или используют «прижизненные» - витальные – красители. Прижизненными красителями являются метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001%.
Недостатками метода являются:
1) трудность исследования неокрашенных микроорганизмов ввиду плохой преломляемости света;
2) невозможность длительно сосредоточить внимание на микробе, т.к. он быстро перемещается из поля зрения.
После микроскопии живых патогенных микроорганизмов мазки обязательно помещают в дезинфицирующий раствор.
В живом состоянии микроорганизмы исследуют методами раздавленной и висячей капли.
Метод раздавленной капли
На чистое предметное стекло наносят каплю воды и исследуемого материала, перемешивают. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Для этого покровное стекло берут за грани, ставят на ребро рядом с каплей и осторожно опускают, не допуская образования пузырьков воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла. Жидкость должна заполнять все пространство между стеклами, но не выступать за края покровного стекла.
На покровное стекло наносят каплю кедрового масло и просматривают препарат под микроскопом с иммерсионным объективом.
Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, изучении запасных веществ клетки и просмотра крупных объектов – микроскопических грибов и дрожжей.
Метод висячей капли
Требуется специальное предметное стекло с лункой посередине (рис. 12.1). На обезжиренное покровное стекло наносят каплю исследуемого материала (рис. 12.2). Покровное стекло накрывают предметным, так чтобы капля была в центре лунки предметного стекла (рис. 12.3). Предметное стекло быстро поворачивают каплей вниз (рис. 12.4). Капля должна свободно свисать в углубление, не соприкасаясь с его дном и краями. Края выемки на предметном стекле предварительно смазывают вазелином. Таким образом, капля оказывается герметически закрытой во влажной камере и защищенной от высыхания.
Рисунок 12. Приготовление препарата висячая капля
Задания:
1. Приготовить препарат исследуемой культуры методом раздавленной капли, окрасив его нейтральным красным (0,0001%) для лучшего изучения под микроскопом.
2. Рассмотреть препарат под микроскопом с иммерсионным объективом, отметить морфологическую форму и способность бактерий к движению, зарисовать.
3. Приготовить препарат исследуемой культуры методом висячей капли, окрасив нейтральным красным (0,0001%).
4. Рассмотреть препарат под микроскопом с иммерсионным объективом, отметить морфологическую форму и способность бактерий к движению, зарисовать.
5. Сделать вывод по работе.
Контрольные вопросы
1. Для каких целей исследуют микроорганизмы в живом состоянии?
2. Какие красители относят к витальным?
3. Каковы недостатки методов исследования микроорганизмов в живом состоянии?
4. Какие методы исследования микроорганизмов в живом состоянии выделяют?
Лабораторная работа № 7
Споры бактерий
Цель работы: освоить технику окрашивания спор у бактерий.
Материалы и оборудование: пробирки с культурами спорообразующих бактерий, микробиологические петли, предметные стекла, красители - метиленовый синий Леффлера, нейтральный красный (0,5%), микроскоп, спиртовки.
Основные положения
Для многих бактерий характерно образование эндогенной споры. Споры образуются при неблагоприятных внешних условиях существования бактерий (высыхание, недостаток питательных веществ, неблагоприятная температура, наличие вредных продуктов обмена и др.). Они представляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образования. По мере образования споры клетка постепенно отмирает. Но в благоприятных условиях спора вновь прорастает в вегетативную форму. Спора является защитным приспособлением для сохранения вида в измененных условиях среды, она чрезвычайно стойка и требует специальных способов окраски.
Спорообразование присуще бациллярным формам, но не коккам и спириллам. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной (рис. 13). В бациллярной клетке спора может располагаться:
1) центрально (палочка сибирской язвы);
2) на конце - терминально (палочка столбняка);
3) ближе к одному из концов - субтерминально (палочка ботулизма).
Если спора превышает диаметр клетки, то в зависимости от ее расположения:
- в центре – клетку называют клостридиальной (рис. 14);
- на конце клетки – плектридиальной.
Рисунок 13. Расположение эндоспор: 1 - бациллярное центральное, 2 - бациллярное терминальное, 4 – клостридиальное, 3 и 5 - плектридиальное
Рисунок 14. Клостридии: А – Clostridium tetani (барабанные палочки);
Б – Clostridium р erfringens; B – Clostridium botulinum (теннисные ракетки)
Споры с трудом вступают в физико-химические реакции с различными веществами, в т.ч. и красками. Поэтому в препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными.
Все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, гидроксидом натрия, перекисью водорода (для размягчения оболочки), затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и, далее, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.
