Сульфатредуцирующие клостридии, преимущественно Clostridium perfringens, - спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при температуре 44⁰С в течение 24-х часов.
Железо-сульфитный агар
В 1л стерильного расплавленного питательного агара (Среда LB (Лурия – Бертрани): триптон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl– 5 г, агар – 20 г, вода – 1 л) добавляют 10г глюкозы, нагревают до расплавления, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при 112 ⁰С 12 минут.20% раствор Na2SO3 и 8% раствор FeSO4 готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор Сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20% раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8% раствора сернокислого железа, перемешивают и разливают с соблюдением правил стерильности в стерильные пробирки высоким столбиком (12-15 см).
Для выделения Clostridium perfringens из природных источников (водоемов, почв) пробы предварительно прогревают на водяной бане при температуре 75 ⁰С в течение 15 мин для исключения вегетативных форм. В пробирки разливают по 5 мл воды и заливают горячим 75-80 ⁰С железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, избегая образования пузырьков воздуха. После этого пробирку быстро охлаждают, помещая ее в емкость с холодной водой для создания анаэробных условий. Посевы инкубируют при 44 ⁰С в течение 24-х часов.
Задания
1. Приготовить 50 мл железо-сульфитного агара.
2. Пробу воды 20 мл прогревают на водяной бане в пробирках при температуре 75⁰С в течение 15 мин.
3. В 4 стерильные пробирки (объем пробирок не менее 15 мл) вносят по 5 мл воды. Посевы заливают горячим 75-80 ⁰С железо-сульфитным агаром.
4. Пробирки быстро охладить и инкубировать при 44⁰С в течение 24-х часов.
5. На следующем занятии записать наблюдения.
6. Сделать выводы
Контрольные вопросы
1. Дайте определение терминам "аэробные микроорганизмы", "анаэробные микроорганизмы", "факультативные микроорганизмы", "облигатные микроорганизмы".
2. Какие методы культивирования анаэробов выделяют?
3. Какой метод применяют для выделения Clostridium perfringens из природных источников?
Лабораторная работа № 11
Выделение чистой культуры бактерий
Цель работы: получить чистые культуры бактерий различными способами.
Материалы и оборудование: чашки Петри с плотной питательной средой (LB), микробиологические петли, шпатель Дригальского, автоматическая пипетка, исследуемые культуры бактерий на жидкой и твердой питательных средах, спиртовки.
Основные положения
Чистой (аксенической), называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида. Умение выделить микроорганизмы одного вида из смешанной популяции, существующей в природе, и поддерживать чистоту культуры – необходимые условия работы с микроорганизмами.
Выделение чистой культуры включает следующие этапы:
1) получение накопительной культуры;
2) выделение чистой культуры;
3) определение чистоты выделенной культуры.
Накопительная культура – культура, в которой преобладают представители одной физиологической группы или даже одного вида микроорганизмов. Для ее получения необходимо создать избирательные (элективные) условия, обеспечивающие преимущественное развитие желаемых микроорганизмов из смешанной популяции.
Чистая культура может быть получена из отдельной колонии или одной клетки.
Выделение из отдельной колонии.
Метод Р. Коха
Накопительную культуру аэробов наносят пипеткой на поверхность плотной среды и стерильным стеклянным шпателем Дригальского распределяют каплю по поверхности среды. Далее этим же шпателем, не стерилизуя его, протирают поверхность среды последовательно во второй, третьей и четвертой чашках. Обычно, в первых двух чашках после инкубации наблюдается сплошной рост микроорганизмов, в последующих – рост изолированных колоний (рис. 16).
Метод истощающего штриха
Накопительную культуру или ее разведение отбирают петлей и на поверхности плотной питательной среды (рис. 17) проводят штрихи в порядке, указанном на рисунке 18. Перед каждым новым штрихом петлю стерилизуют в пламени горелки.
После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз, чтобы конденсационная вода (в случае ее образования на крышке) не помешала получить изолированные колонии. Чашки выдерживают в термостате в течение 1-7 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. Выросшие изолированные колонии (рис. 19) отсевают петлей на поверхность скошенной плотной среды в пробирке или в жидкую среду.
Рисунок16. А - шпатель Дригальского; Б - посев микроорганизмов с помощью шпателя Дригальского; В - рост микроорганизмов после рассева
Рисунок17. Посев микроорганизмов на плотные питательные среды с помощью микробиологической петли.
Рисунок18. Схема последовательности рассева культуры микроорганизмов на поверхность твердой питательной среды
Рисунок 19. Изолированные колонии бактерий, полученные
методом истощающего штриха
Метод глубинного посева
Изолированные колонии микроаэрофилов и факультативных анаэробов получают методом глубинного посева. Для этого плотную питательную среду предварительно разливают в пробирки по 15-20 мл и стерилизуют. В остывшую до 48 – 50 °С среду вносят 0,5 – 1,0 мл предварительно сделанного разведения накопительной культуры. Посевной материал тщательно перемешивают, вращая пробирку между ладонями и далее, быстро выливают в чашку Петри, сохраняя стерильность. Чашки помещают в термостат. Колонии, выросшие в толще среды, вырезают стерильным скальпелем или извлекают петлей и переносят в жидкую среду.
Выделение из одной клетки
Капельный метод
Используют при работе с крупными микроорганизмами: дрожжами, микроскопическими грибами, цианобактериями. Накопительную культуру разводят в стерильной среде так, чтобы в небольшой капле были одиночные клетки микроорганизмов. Далее на поверхность нескольких стерильных покровных стекол наносят по капле приготовленного разведения. Готовят препараты «висячая капля». Капли просматривают под микроскопом и отмечают те, в которых обнаружена только одна клетка. Препарат помещают в термостат во влажную камеру (чашка Петри с увлажненной фильтровальной бумагой). Через 24 ч отмеченные капли вновь микроскопируют. Там, где наблюдается образование микроколоний, осторожно снимают с покровного стекла кусочками фильтровальной бумаги и переносят в пробирки с питательной средой.
