1.Приготовить и зафиксировать препарат исследуемой культуры.
2.Нанести на препарат 5% раствор хромовой кислоты на 5-10 минут. Смыть водой.
3.Накрыть препарат полоской фильтровальной бумаги. Обильно смочить бумагу карболовым фуксином Циля. Подогреть препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), добавить новую порцию красителя. Процедуру проводить в течение 7 минут, следя, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала.
4.Бумагу снять, препарат охладить и промыть водой. Подсушить фильтровальной бумагой.
5.Для обесцвечивания цитоплазмы клеток препарат обработать 1% раствором соляной или серной кислот в течение 15-30 с.
6.Препарат промыть водой и окрасить метиленовым синим в течение 2 мин.
7.Препарат микроскопировать с иммерсионным объективом. Окраска получается контрастной: ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.
Окраска препарата методом Пешкова
1.На фиксированный препарат налить метиленовый синий Леффлера, довести его до кипения и кипятить 15-20 с.
2.Препарат промыть водой.
3.Докрасить препарат 0,5% водным раствором нейтрального красного в течение 30 с.
4.Препарат промыть водой, подсушить.
5.Препарат микроскопировать с иммерсионным объективом. Окраска получается контрастной: споры окрашиваются в голубой или синий цвет, цитоплазма – в розовый.
Задания
1. Приготовить препарат споросодержащих бактерий и окрасить его методом Пешкова или методом Циля-Нильсена.
2. Препарат зарисовать и сделать вывод по работе.
Контрольные вопросы
1. Почему бактерии образуют споры?
2. Какие бактерии могут образовывать споры?
3. Как подразделяют бактерии в зависимости от расположения споры?
4. Как могут располагаться споры внутри клетки? Приведите примеры микроорганизмов.
5. В чем заключается трудность обнаружения спор у бактерий?
6. Какой принцип положен в основу окраски спор бактерий?
РАЗДЕЛ 3: ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД
Лабораторная работа № 8
Питательные среды для культивирования микроорганизмов. Приготовление питательных сред различного состава
Цель работы: познакомиться с классификацией и назначением питательных сред, овладеть навыком приготовления различных питательных сред.
Материалы и оборудование: стеклянные колбы различного объема, весы технические и аналитические, компоненты питательных сред.
Основные положения
Микроорганизмы так же, как и любой другой живой организм для роста и размножения нуждаются в питательных веществах, которые содержит субстрат. В микробиологии культивирование микроорганизмов происходит с использованием питательных сред разных по составу. Состав питательной среды определяется потребностями микроорганизма в питании или задачами эксперимента.
Питательная среда должна содержать:
- доступный для клетки источник энергии (для фототрофов – свет, для остальных – органический или неорганический субстрат);
- все необходимые компоненты для реализации конструктивных процессов.
Необходимые компоненты:
1) источник углерода (СО2, углеводы, кислоты, спирты);
2) источник азота (молекулярный азот воздуха, неорганические соли азота, аминокислоты);
3) факторы роста (пурины, пиримидины, аминокислоты, витамины);
4) макроэлементы – калий, натрий, магний, кальций, железо и др.;
5) микроэлементы – молибден, цинк, медь, кобальт и др.
Растворы микроэлементов, аминокислот и витамины стерилизуют отдельно и вносят в среду непосредственно перед посевом.
Классификация питательных сред
По составу
По составу все питательные среды делятся на натуральные (естественные), синтетические и полусинтетические.
Натуральные (естественные) – состоят из продуктов животного и (или) растительного происхождения (мясо, молоко, разведенная кровь, картофель, морковь и т.д.). Эти среды богаты органическими веществами, однако имеют сложный и непостоянный состав, поэтому малопригодны для исследования обмена веществ микроорганизмов.
К естественным питательным средам относятся:
– мясопептонный бульон (МПБ) – состоит из экстракта мяса (500 г мяса на 1 л воды, экстракция 12 ч при комнатной температуре), 0,5 % NaCl и 1 % пептона (продуктов неполного разложения белка). Для приготовления мясопептонного агара (МПА) к бульону добавляют агар-агар (1,5 - 2%), стерилизуют при 2 атм 20-30 мин;
– неохмеленное пивное сусло, приготовляется на основе солода (проросшего ячменя), гидролизованного до сахаров, стерилизуют при 1,5 атм 20-30 мин;
– дрожжевая среда: экстракт дрожжей (7-10 г на 1 л воды), 1-2 % раствор сахарозы (глюкозы или фруктозы), 0,1 %K2HPO4, 0,5 %NaCl, стерилизуют при 1,5 атм 20-30 мин;
– картофельный агар (отвар 200 г картофеля на 1 л воды с добавлением агар-агара), стерилизуют при 2 атм 40-45 мин.
На натуральных средах хорошо развиваются все микроорганизмы, т.к. эти среды содержат все необходимые для роста компоненты, однако их состав химически непостоянен и зависит от свойств биологического объекта, из которого они изготовлены.
Полусинтетические – наряду с компонентами естественного происхождения содержат химические вещества, полученные синтетическим путем. К таким средам относится МПА с добавлением глюкозы и K2HPO4, искусственные среды с добавлением факторов роста (дрожжевого автолизата, кукурузного экстракта и т.д.).
Среда LB (Лурия – Бертрани): триптон – 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl - 5 г, вода – 1 л; стерилизуют при 1,5 атм 20-30 мин.
Синтетические – это комплекс определенных химически чистых соединений, взятых в точно указанных концентрациях. Они наиболее удобны для изучения метаболизма микроорганизмов.
К синтетическим питательным средам относятся:
- среда Чапека (для культивирования грибов): глюкоза – 30 г, NaNO3 – 2 г, K2HPO4 – 1 г, MgSO4 – 0,5; KCl – 0,5; FeSO4 – 0,01; вода – 1 л; стерилизуют при 1,5 атм 20-30 мин;
- среда Канеда (для культивирования метилотрофов): KH2PO4 – 2 г, (NH4)2SO4 – 2 г, NaCl 0,5 г, MgSO4 – 0,025 г, FeSO4 – 0,01 г, вода – 1 л; стерилизуют при 2 атм 20-30 мин; после стерилизации в среду вносят 0,3% стерильного метанола (стерилизуют фильтрованием).
- среда Эванса (для культивирования псевдомонад): K2HPO4х 3Н2О- 8,71 г растворить в 800 мл воды, довести pH до 7,00. Добавить по 1 мл следующих растворов:
- 5 М р-р NH4Cl (можно заменить NH4NO3)
- 0,1 М р-р Na2SO4
- 62 мM р-р MgCl2
- 1 мM р-р CaCl2
- 0,005 мM р-р (NH4)6Mo7O24
- микроэлементы (10 мл HCl + 990 мл H2O дист. + 0,41 г ZnO + 5,4 г FeCl3х6H2O + 2,00 г MnCl2х4H2O + 0,17 г CuCl2х2H2O + 0,48 г CoCl2х6H2O + 0,06 г H3BO3)
Довести объем среды до 1л дистиллированной водой.
По назначению
По назначению питательные среды делятся на:
Элективные среды – обеспечивают преимущественное развитие одного вида или группы микроорганизмов и малопригодны (непригодны) для культивирования других. Обычно их применяют на первом этапе выделения микроорганизмов из естественных субстратов для получения накопительных культур (например, среда Эшби для рода Azotobacter).
Дифференциально-диагностические (индикаторные) – предназначены для того, чтобы быстро отличить одни виды микроорганизмов от других (например, среда Эндо для бактерий группы кишечной палочки).
- Среда Эндо: пептон ‑ 10 г/л, лактоза ‑ 10 г/л, K2HPO4 ‑ 2,5 г/л, фуксин ‑ 0,3г/л, Na2SO3‑ 0,5г/л, агар‑ 12 г/л.
Универсальные - среды, на которых хорошо растут многие патогенные и непатогенные виды микроорганизмов (например, среда Лурия-Бертрани).
По физическому состоянию
По физическому состоянию среды делят на:
Плотныесреды (на основе агара, желатина или силикагеля) – предназначены для выделения чистых культур микроорганизмов, диагностических целей, для хранения культур, количественного учета микроорганизмов, определения антагонистических свойств.
Агар-агар представляет собой полисахарид, в состав которого входят агароза и агаропектин. Получают из морских бурых или красных водорослей. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата. В воде агар-агар образует гель, плавящийся при 100 °С и затвердевающие при температуре 40-45 °С. В количественном соотношении агар, как правило, составляет 1,5-2 % от состава среды (15-20 г/л). Его можно вносить в уже готовые среды и нагревать до расплавления.
Желатин – белок животного происхождения, получаемый при вываривании костей и хрящей животных. Он плавится при температуре 23-26°С. В составе сред желатин составляет 10-15 % (100-150 г/л).
Кремнистый гель (силикагель) – вещество неорганического происхождения, использующееся как основа для плотных синтетических сред. Его используют в случаях, когда требуются плотные среды, не содержащие органических компонентов (для хемолитотрофов). Силикагелем называют двуокись кремния (SiO2). Его стерильный золь готовят из раствора силиката натрия или калия (Na2SiO3, К2SiO3) и перед использованием, для того чтобы вызвать образование геля, к нему добавляют питательную среду, содержащую электролиты. Среды на основе силикагеля (1,5–2,0 %) используют для получения культур автотофных бактерий, так как при этом в среде отсутствуют органические вещества. При добавлении в такие минеральные среды различных органических веществ можно исследовать возможность использования их в качестве единственных источников углерода гетеротрофными бактериями. С помощью силикагелиевых сред также можно определять потребности бактерийв витаминах.
Жидкие среды – предназначены для выявления физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, накопления биомассы и продуктов метаболизма, поддержания и хранения микроорганизмов, плохо развивающихся на плотных средах.
Полужидкие среды – получают добавлением к жидким средам 0,5% агара. Используют для специальных целей, например для культивирования анаэробов.
Сыпучие среды – применяются в промышленной микробиологии (разваренное пшено, отруби, песок, пропитанные питательным раствором).
Задание:
Приготовить жидкие и плотные питательные среды по выбору преподавателя. Колбы со средами закрыть фольгой и бумагой, зафиксировать их резинкой, подписать (название среды, номер группы, дата приготовления) и сдать на стерилизацию.
Варианты:
1) приготовить жидкую и агаризованную питательную среду Лурия – Бертрани (LB) объемом 300 мл в термостатированных колбах;
2) приготовить жидкую питательную среду Канеда объемом 100 мл в термостатированных колбах;
3) приготовить жидкую и агаризованную питательную среду Эванса объемом 300 мл в термостатированных колбах;
4) приготовить агаризованную питательную среду Чапека объемом 100 мл;
5) приготовить среду Эндо объемом 100мл.
Контрольные вопросы
1. Какие основные компоненты должна содержать питательная среда?
2. На какие группы делят питательные среды по составу? Приведите примеры.
3. На какие группы делят питательные среды по назначению? Приведите примеры.
4. В чем различие элективных сред от дифференциально-диагностических?
5. На какие группы делят питательные среды по физическому состоянию? Приведите примеры.
6. Какие вещества используют для приготовления плотных питательных сред? Дайте характеристику этих веществ.
Лабораторная работа № 9
