Существует несколько разновидностей хроматографического метода анализа. Для разделения аминокислот наиболее доступным и сравнительно точным является метод распределительной хроматографии на бумаге.
Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.).
Сущность метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель всасывается хроматографической бумагой и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного растворителя употребляют, например, водонасыщенный раствор фенола, бутиловый спирт, амиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают хроматографическую бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за его фронтом.
Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином. Реакцию проводят путем опрыскивания из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,5 % спиртовым раствором нингидрина и последующим нагреванием в сушильном шкафу. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета (в зависимости от химической структуры аминокислоты). Основной физико-химической характеристикой хроматографического процесса является коэффициент распределения Kd.
Коэффициент распределения (Kd) характеризует распределение вещества между подвижной и неподвижной фазами при достижении равновесия в хроматографическом процессе. Определить Kd непосредственно из эксперимента (т.е. найти концентрацию соединения в подвижной и неподвижной фазе) довольно сложно. Поэтому в качестве основной характеристики удерживания вещества, определяющей положение его зоны на бумаге используется фактор Rf. Фактором Rf называют отношение расстояния (в мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна а к расстоянию (в мм) от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (в):
Rf=а/в
Фактор Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и т. д.). Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот - «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму.
Исследуемые растворы аминокислот наносят вблизи центра бумажного диска, зажатого по краям. Смесь растворителей подводят к центру диска при помощи «ножек» из бумаги. Проводят разделение смеси, состоящей из трех аминокислот.
1 Цель работы – провести разделение и идентификацию аминокислот методом бумажной хроматографии
Приборы и материалы
Хроматографическая камера
Хроматографическая бумага
Электроплитка
Система растворителя - бутанол:уксусная кислота (конц.):вода в соотношении 3:1:1,4
Задача (раствор, содержащий смесь аминокислот)
Растворы аминокислот – «свидетелей» (глицин, лейцин, триптофан)
Раствор нингидрина в ацетоне 0,5 %.
Описание работы
1. Нанесение раствора на хроматографическую бумагу.
Из хроматографической бумаги вырезают диск диаметром 14 см. Диск перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг к другу, и от центра круга чертят квадрат со стороной 2 см, далее делают надрез по диагоналям квадрата; полученные в виде уголков «ножки» отгибают. На расстоянии 0,5 см от линий сгиба «ножек» простым карандашом чертят еще один квадрат, на середине каждой стороны отмечают точки. В одну точку при помощи капилляра наносят небольшую каплю исследуемого раствора смеси аминокислот. Диаметр полученного пятна не должен превышать 3 – 4 мм. В три другие точки наносят растворы аминокислот-«свидетелей», входящих в исследуемую смесь. Рядом с точкой нанесения необходимо обозначить объект нанесения (задача, название аминокислоты-«свидетеля») простым карандашом. На одну и ту же точку следует наносить по 2 – 3 капли раствора, при этом после нанесения каждой капли бумагу слегка просушивают на воздухе и лишь затем наносят следующую каплю.
2. Разделение в хроматографической камере.
Просушенную на воздухе хроматограмму помещают между двумя половинами чашек Петри с одинаковыми диаметрами, образующими хроматографическую камеру, так, чтобы «ножки» хроматограммы были погружены в органический растворитель бутанол – вода – уксусная кислота (3:1,4:1), который наливают в нижнюю чашку. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре около 40 минут. Необходимо следить за линией фронта растворителя.
Насыщенный водой бутиловый спирт в уксусной кислоте впитывается бумажным диском и движется по нему, увлекая нанесенные вещества. Дальнейшее продвижение растворителя вызывает разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью соответственно коэффициентам их распределения между водой и органическим растворителем.
3. Проявление хроматограммы.
После того как фронт растворителя пройдет 4/5 длины хроматограммы, хроматограмму извлекают из камеры, отмечают карандашом фронт растворителя и сушат на воздухе под тягой до удаления растворителя. После этого хроматограмму проявляют, опуская в 0,5 % раствор нингидрина в ацетоне, и помещают в сушильный шкаф на 5 мин при температуре 80— 100°С, также можно проявить хроматограмму, нагревая ее над электроплиткой. На хроматограмме появляются пятна сине-фиолетового цвета. С помощью линейки измеряют расстояния а – от места нанесения капли до середины каждого пятна и в – от места нанесения капли до фронта растворителя. Проявившиеся пятна обводят карандашом и вычисляют фактор Rf для каждой аминокислоты. Сопоставляя положения пятен исследуемого раствора с положением пятен «свидетелей», определяют наличие тех или иных аминокислот в исследуемой смеси.
