Лабораторная работа 10. Хроматографический метод определения аминокислот

Существует несколько разновидностей хроматографиче­ского метода анализа. Для разделения аминокислот наибо­лее доступным и сравнительно точным является метод рас­пределительной хроматографии на бумаге.

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которых является вода, другой — водонасыщенный органический растворитель (фенол, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и др.).

Сущность метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, конец которой опускают в под­ходящий органический растворитель. Растворитель всасыва­ется хроматографической бумагой и увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты. Скорость перемещения аминокислот на бумаге зависит от химического строения аминокислот и их способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителе. В качестве подвижного раство­рителя употребляют, например, водонасыщенный раствор фе­нола, бутиловый спирт, амиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают хроматографическую бумагу (внешне бумага остается сухой). Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся вслед за его фронтом.

Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить при помощи цветной реакции с нингидрином. Реакцию про­водят путем опрыскивания из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,5 % спиртовым раствором нингидрина и последующим нагреванием в сушильном шкафу. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета (в зависимости от химической структуры аминокислоты). Основной физико-химической характеристикой хроматографического процесса является коэффициент распределения Kd.

Коэффициент распределения (Kd) характеризует распределение вещества между подвижной и неподвижной фазами при достижении равновесия в хроматографическом процессе. Определить Kd непосредственно из эксперимента (т.е. найти концентрацию соединения в подвижной и неподвижной фазе) довольно сложно. Поэтому в качестве основной характеристики удерживания вещества, определяющей положение его зоны на бумаге используется фактор Rf. Фактором Rf называют отношение расстояния (в мм) от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна а к расстоянию (в мм) от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (в):

Rf=а/в

Фактор Rf является характерной вели­чиной для каждой аминокислоты и постоянен при данных условиях опыта (растворитель, температура, сорт бумаги и т. д.). Идентификация аминокислот на хроматограммах проводится путем использования чистых аминокислот - «свидетелей», наносимых на ту же хроматограмму.

Исследуемые растворы аминокислот наносят вблизи цент­ра бумажного диска, зажатого по краям. Смесь растворите­лей подводят к центру диска при помощи «ножек» из бума­ги. Проводят разделение смеси, состоящей из трех аминокис­лот.

 

1 Цель работы – провести разделение и идентификацию аминокислот методом бумажной хроматографии

 

Приборы и материалы

Хроматографическая камера

Хроматографическая бумага

Электроплитка

Система растворителя - бутанол:уксусная кислота (конц.):вода в соотношении 3:1:1,4

Задача (раствор, содержащий смесь аминокислот)

Растворы аминокислот – «свидетелей» (глицин, лейцин, триптофан)

Раствор нингидрина в ацетоне 0,5 %.

 

Описание работы

1. Нанесение раствора на хроматографическую бумагу.

Из хроматографической бумаги вырезают диск диаметром 14 см. Диск перегибают по диаметрам, перпендикулярным друг к другу, и от центра круга чертят квадрат со стороной 2 см, далее делают надрез по диагоналям квадрата; полученные в виде уголков «ножки» отгибают. На расстоянии 0,5 см от линий сгиба «но­жек» простым карандашом чертят еще один квадрат, на середине каждой стороны отмечают точки. В одну точку при помощи капилляра наносят небольшую каплю исследуемого раствора смеси аминокислот. Диаметр получен­ного пятна не должен превышать 3 – 4 мм. В три другие точ­ки наносят растворы аминокислот-«свидетелей», входящих в исследуемую смесь. Рядом с точкой нанесения необходимо обозначить объект нанесения (задача, название аминокислоты-«свидетеля») простым карандашом. На одну и ту же точку следует наносить по 2 – 3 капли раствора, при этом после нанесения каждой капли бумагу слегка просушивают на воздухе и лишь затем наносят сле­дующую каплю.

2. Разделение в хроматографической ка­мере.

Просушенную на воздухе хроматограмму помещают между двумя половинами чашек Петри с одинаковыми диа­метрами, образующими хроматографическую камеру, так, чтобы «ножки» хроматограммы были погружены в органический растворитель бутанол – вода – уксусная кислота (3:1,4:1), который наливают в нижнюю чашку. Хроматографическое разделение проводят при комнатной температуре около 40 минут. Необходимо следить за линией фронта растворителя.

Насыщенный водой бутиловый спирт в уксусной кислоте впитывается бумажным диском и движется по нему, увлекая нанесенные вещества. Дальнейшее продвижение растворите­ля вызывает разделение исследуемой смеси на отдельные аминокислоты, движущиеся с разной скоростью соответствен­но коэффициентам их распределения между водой и органи­ческим растворителем.

3. Проявление хроматограммы.

После того как фронт растворителя пройдет 4/5 длины хроматограммы, хроматограмму извлекают из камеры, отмечают ка­рандашом фронт растворителя и сушат на воздухе под тягой до удаления растворителя. После этого хроматограмму проявляют, опус­кая в 0,5 % раствор нингидрина в ацетоне, и помещают в сушильный шкаф на 5 мин при температуре 80— 100°С, также можно проявить хроматограмму, нагревая ее над электроплиткой. На хроматограмме появляются пятна сине-фиолетового цвета. С по­мощью линейки измеряют расстояния а – от места нанесе­ния капли до середины каждого пятна и в – от места нане­сения капли до фронта растворителя. Проявившиеся пятна обводят карандашом и вычисляют фактор Rf для каждой аминокислоты. Сопостав­ляя положения пятен исследуемого раствора с положением пятен «свидетелей», определяют наличие тех или иных ами­нокислот в исследуемой смеси.