Ћекции.ќрг


ѕоиск:




 атегории:

јстрономи€
Ѕиологи€
√еографи€
ƒругие €зыки
»нтернет
»нформатика
»стори€
 ультура
Ћитература
Ћогика
ћатематика
ћедицина
ћеханика
ќхрана труда
ѕедагогика
ѕолитика
ѕраво
ѕсихологи€
–елиги€
–иторика
—оциологи€
—порт
—троительство
“ехнологи€
“ранспорт
‘изика
‘илософи€
‘инансы
’ими€
Ёкологи€
Ёкономика
Ёлектроника

 

 

 

 


Ћабораторна€ работа 1. Ѕиуретова€ реакци€




ј.¬. јнкудинова, ¬.√. Ўмелева,

≈.». ѕомешалкин

 

 

Ћабораторный практикум

ѕо химии белка

ћетодические указани€

 

—анкт-ѕетербург


”ƒ  577.112

 

јнкудинова ј.¬. Ћабораторный практикум по химии белка [текст]: методические указани€ / ј.¬. јнкудинова, ¬.√. Ўмелева, ≈.». ѕомешалкин. Ц —ѕб.: —ѕб√“»(“”), 2010. Ц 42 с.

 

 

¬ методических указани€х представлены основные лабораторные работы необходимые дл€ практического изучени€ биохимических процессов в клетке.

ћетодические указани€ предназначены дл€ студентов 3 курса факультета тонкого органического и микробиологического синтеза и соответствуют рабочей программе по дисциплине ЂЅиологическа€ хими€ї.

 

 

“абл. 6. »л. 1. Ѕиблиогр. 4 назв.

 

 

–ецензент:

 

ƒ.ќ. ¬иноходов, д-р биол. наук, профессор кафедры молекул€рной биотехнологии —ѕб√“»(“”)

 

 

”тверждены на заседании учебно-методической комиссии факультета тонкого органического и микробиологического синтеза 21.09.2010

 

–екомендованы к изданию –»—о —ѕб√“» (“”)

 

¬¬≈ƒ≈Ќ»≈

 

Ѕиологическа€ хими€ €вл€етс€ одной из наиболее важ≠ных теоретических дисциплин в системе биологического об≠разовани€ инженеров-технологов микробиологических про≠изводств.

Ќасто€щие методические указани€ включают цикл лабо≠раторных работ по разделу Ђ’ими€ белкаї. ќписанию каж≠дой работы предшествует краткий теоретический материал с описанием механизмов протекани€ реакций. ¬ конце даны контрольные вопросы, которые могут использоватьс€ сту≠дентами дл€ подготовки к контрольным работам, а также дл€ самосто€тельной работы.

’»ћ»„≈— јя ѕ–»–ќƒј Ѕ≈Ћ ј

—реди органических соединений, встречающихс€ в клет≠ке, первое место занимают белки Ц на их долю приходитс€ не менее 50% сухого веса клетки. ѕо химической природе белки представл€ют собой высокомолекул€рные соединени€, построенные из сотен или тыс€ч аминокислотных остатков. ¬ белковых молекулах аминокислоты располагаютс€ таким образом, что карбоксильна€ группа одной аминокислоты св€≠зана с α-аминогруппой другой пептидной св€зью.

” аминокислот, имеющих две аминогруппы (лизин, арги≠нин) или две карбоксильные группы (аспарагинова€, глютаминова€), в реакцию образовани€ пептидов вступают толь≠ко те карбоксильные и аминогруппы, которые сто€т у α-углеродного атома.

ћолекула белка состоит из одной или нескольких поли≠пептидных цепей, соединенных между собой главным обра≠зом водородными св€з€ми.  роме водородных св€зей в моле≠куле белка между полипептидными цепочками возникают и другие св€зи (например, эфирные, дисульфидные и др.), об≠разованные за счет фенольных (тирозин), спиртовых (серин), сульфгидрильных (цистеин) и других групп, имеющихс€ в полипептидных цепочках.

 аждый тип белка обладает особым, свойственным только ему химическим составом, определенным молекул€рным весом и специфической последовательностью аминокислотных остатков. Ёто и определ€ет разнообразие существующих в природе белков (табл. 1).

ѕрисутствие белка в биологических объектах или рас≠творах можно обнаружить с помощью цветных реакций, ко≠торые обусловлены наличием аминокислот в белке, их спе≠цифическими группами или пептидными св€з€ми.

–€д химических веществ дает окраску продуктов реакции при взаимодействии с белками. Ёти реакции примен€ютс€ дл€ качественного и количественного определени€ белка и присутствующих в нем аминокислот.

 

“аблица 1 Ц јминокислоты, встречающиес€ в белках

јминокислота ‘ормула —окра- щенное обозначение
I јлифатические аминокислоты 1 ћоноаминомонокарбоновые кислоты
     
√лицин (α-аминоуксусна€ кислота) гли
јланин (α-аминопропионова€ кислота) ала
¬алин (α-аминоизовалерианова€ кислота) вал
Ћейцин (α-аминоизокапронова€ кислота) лей
»золейцин (α-амино-β-метил-валерианова€ кислота) илей
—ерин (α-амино-β-окси-пропионова€ кислота) сер
“реонин (α-амино-β-оксимасл€на€ кислота) тре
2 ƒиаминомонокарбоновые кислоты
Ћизин (α,ε-диаминокапрнова€ кислота) лиз
јргинин (α-амино-β-гуанидин-валерианова€ кислота) арг
ѕродолжение табл.1
     
3 ћоноаминодикарбоновые кислоты
јспарагинова€ (амино€нтарна€ кислота) асп
јспарагин (амид аспарагиновой кислоты) асн
√лутаминова€ (α-аминоглутарова€ кислота) глу
√лутамин (амид глутаминовой кислоты) глн
4 —еросодержащие аминокислоты
÷истеин (α-амино-β-тио-пропионова€ кислота) цис
ћетионин (α-амино-γ-метил-тиомасл€на€ кислота) мет
II јроматические аминокислоты
‘енилаланин (α-амино-β-фенил-пропионова€ кислота) фен
“ирозин (α-амино-β-гидрокси-фенилпропионова€ кислота) тир
ѕродолжение табл.1
III √етероциклические аминокислоты
     
ѕролин (пирролидин-α-карбонова€ кислота) про
“риптофан (α-амино-β-индолил-пропионова€ кислота) три
√истидин (α-амино-β-имидазолил-пропионова€ кислота) гис
       

 

—уществуют универсальные цветные реакции, которые дают все белки (биуретова€ и нингидринова€).  роме того, имеютс€ специфические реакции, которые обусловлены на≠личием только определенных аминокислот в молекуле белка (ксантопротеинова€, ћиллона, ‘ол€ и др.); многие из них весьма чувствительны и высокоспецифичны, что позвол€ет открывать ничтожные количества той или иной индивидуаль≠ной аминокислоты в составе сложных смесей, биологических жидкост€х, гидролизатах белков и т.п. Ќа основании неко≠торых цветных реакций разработаны методы количествен≠ного определени€ белков и аминокислот.

 

Ћабораторна€ работа 1. Ѕиуретова€ реакци€

 

Ѕиуретова€ реакци€ получила свое название от произ≠водного мочевины Ц биурета, образующегос€ при нагревании мочевины с отщеплением от нее аммиака:

 

 

Ѕиуретова€ реакци€ открывает в белке пептидную св€зь

 

(она имеетс€ и в биурете). ќднако эту реакцию способны давать вещества, содержащие не менее двух пептидных св€≠зей.

ѕри добавлении к сильно щелочному раствору белка или продукту его неполного гидролиза сульфата меди, образуютс€ комплексные соединени€ меди, окрашенные в красно-фиолетовый или си≠не-фиолетовый цвет. »нтенсивность окраски зависит от дли≠ны пептида.

Ѕиуретовую реакцию дают аспарагин (амид аспарагиновой кислоты) и аминокислоты гистидин, треонин и серии.

√руппа, образующа€ пептидную св€зь в щелочной среде, присутствует в своей таутомерной енольной форме:

 

 

ѕри избытке щелочи происходит диссоциаци€ ќЌ-группы, по€вл€етс€ отрицательный зар€д, с помощью которого кислород взаимодействует с медью; кроме того, медь обра≠зует дополнительные координационные св€зи с атомами азота, участвующими в пептидной св€зи, путем использовани€ их неподеленных электронных пар. ¬озникающий таким об≠разом комплекс очень стабилен.

 

1 ÷ель работы - провести биуретовую реакцию, котора€ обнаруживает пептидные св€зи в белке

 

ѕриборы и материалы

Ѕелок 1 %

≈дкий натр 10 %

—ернокисла€ медь 1 %

 

ќписание работы

  п€ти капл€м 1 % раствора белка прибавл€ют три капли 10 % раствора едкого натра, одну каплю 1 % рас≠твора сернокислой меди и перемешивают. —одержимое про≠бирки приобретает сине-фиолетовый цвет.

Ќельз€ добавл€ть избыток сернокислой меди, поскольку синий осадок меди маскирует характерное фиолетовое окра≠шивание биуретового комплекса белка.

 

 

 онтрольные вопросы

1. Ќаличие какой св€зи в молекуле белка обеспечивает протекание данной цветной реакции?

2. ¬се ли белки дают данную цветную реакцию

3. ќт чего зависит интенсивность окраски в биуретовом методе?

 

 

1.2 Ћабораторна€ работа 2. Ќингидринова€ реакци€ на α-аминокислоты

–астворы белка, пептидов и аминокислот дают синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином при нагревании. ¬се аминокислоты можно рассматривать как -замещенные про≠изводные аминоуксусной кислоты. ѕри окислении они рас≠щепл€ютс€:

 

 

 

¬ качестве окислителей можно применить органическое соединение - нингидрин (трикетогидринденгидрат):

 

 

“рикетогидринден Ќингидрин

 

 

—начала нингидрин восстанавливаетс€ аминокислотой до ендиола:

 

1. ƒекарбоксилирование

2. ƒезаминирование

3. ќкисление

1.

 

≈ндиол

 

«атем конденсируетс€ с аммиаком и второй молекулой нингидрина, образу€ краситель типа мурексида (пурпурный –уэмана), который в нейтральных и слабощелочных растворах существует в виде окрашенного иона (аниона). ќкраска обусловлена наличием всине-фиолетовом –уэмана цепи конъюгации с ионными зар€дами по концам цепи:

 

 

 

 

¬ насто€щее врем€ нингидринова€ реакци€ исключитель≠но широко используетс€ как дл€ открыти€ отдельных амино≠кислот, так и дл€ их количественного определени€.

—ине-фиолетовый –уэмана на хроматограмме довольно быстро (в течение нескольких дней) разрушаетс€. „тобы из≠бежать обесцвечивани€ п€тен на хроматограмме, ее протас≠кивают через насыщенный раствор азотнокислой меди в 90 % ацетоне. ѕри этом сине-фиолетовый –уэмана превра≠щаетс€ в комплексную медную соль красного цвета. ¬ таком виде, хроматограмма может хранитьс€ несколько мес€цев.

 

1 ÷ель работы - провести качественную реакцию с нингидриновым реактивом на α-аминокислоты

 

ѕриборы и материалы

 

¬од€на€ бан€

Ёлектроплитка

Ѕелок 1 %

√идролизат белка

јминокислота 2 %

Ќингидрин 0,1 %

 

ќписание работы

¬ 1-ю пробирку наливают п€ть капель 1 % раствора белка, во 2-ю Ц п€ть капель гидролизата белка, в 3-ю Ц 2 мл 2 % раствора аминокислоты. ¬о все три пробирки наливают п€ть капель 0,1 % водного раствора нингидрина и кип€т€т 1 Ц 2 мин. Ќаблюдают по€вление розово-фиолето≠вого или сине-фиолетового окрашивани€. «атем раствор си≠неет.

 

 

 онтрольные вопросы

 

1.„то вы€вл€ет нингидринова€ реакци€?

2.¬ чем принцип метода?

 





ѕоделитьс€ с друзь€ми:


ƒата добавлени€: 2017-02-28; ћы поможем в написании ваших работ!; просмотров: 10833 | Ќарушение авторских прав


ѕоиск на сайте:

Ћучшие изречени€:

¬ моем словаре нет слова Ђневозможної. © Ќаполеон Ѕонапарт
==> читать все изречени€...

454 - | 421 -


© 2015-2023 lektsii.org -  онтакты - ѕоследнее добавление

√ен: 0.036 с.