Самостоятельная работа студентов. I. Изучение микрофлоры кожи. А) исследование смывов с поверхности кожи рук

I. Изучение микрофлоры кожи. а) Исследование смывов с поверхности кожи рук. Стерильным тампоном, смоченным в среде Кесслера (пептонная вода с лактозой, желчью и генциан-виолетом), делают смывы с обеих рук, протирая ладони, межпальцевые промежутки и подногтевые пространства, тампон помещают в среду Кесслера, инкубируют в термостате при 37⁰ С 24 часа. б) посевы-отпечатки пальцев на сектора чаш­ки со средой Левина. Учет результатов посевов будет выполнен на следующем занятии.

2. Изучение микрофлоры полости рта. Приготовление мазка из зубного налета. Окраска по Граму или по Бурри. Препарат промикроскопировать и зарисовать.

3. Исследование микрофлоры зева. Произвести отбор материала из зева с помощью тампона, приготовить мазок, окрасить по Граму, промикроскопировать. Микрокартину зарисовать.

4. Изучение микрофлоры кишечника (демонстрация). Из исследуемых фекалий готовят разведения 10 ^-2, 10^-4, 10^-6 и т.д. По 0,1 мл каждого разведения засевают на среды Эндо, кровяной, желточно-солевой агар, среды Сабуро, Блаурокка (печеночный агар с лакто­зой и цистином), другие питательные среды и инкубируют при 37⁰ С. Подсчитывают число выросших колоний и определяют число КОЕ в 1 г материала. Проводят отсев 2—3 колоний каждого вида для выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов по биохимическим свойствам. Содержание микрофлоры кишечника в колониеобразующих единицах (КОЕ) у здорового человека представлено в таблице 5. На основании учета демонстрационных посевов сделать выводы о состоянии микробиоценоза кишечника обследованного пациента.

5. Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведении (демонстрация). Метод применяют для определения минимальной подав­ляющей концентрации (МПК) — наименьшей концентрации антибиотика, полностью подавляющей рост исследуемых бак­терий. Для этого готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом, буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовле­ния 2-кратных серийных разведений антибиотика (от 1 до 128 ед/мл) в питатель­ной среде — бульоне (в объеме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плот­ности и засевают по 0,1 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль куль­туры). Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 20—24 ч или более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подав­ляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.

6. Микротест-системы для определения чувствительности к ан­тимикробным препаратам (демонстрация) предназначены для быстрого определения клинической чувствительности бактерий к антибиотикам, которые в 2 стандартных концентрациях (средней терапевтической и

Таблица 5.

Содержание микрофлоры кишечника здорового человека в норме (КОЕ/грамм фекалий)

мак­симальной) находятся в лунках пластиковых планшетов. Мерной бактериологической петли (объем 1 мкл) исследуемую чистую культуру вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, приготовленную бактериальную суспензию разлива­ют в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в при­сутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма при­водит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельнос­ти микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.

7. Определение клинической чувствительности бактерий к анти­микробным препаратам методом дисков (диффузионный тест) - демонстрация. Метод основан на подавлении роста бактерий на плотной питательной среде под действием строго определенной концентрации антибиотика, содержащегося в стандартном бумажном диске. Препарат, диффундируя в агар создает вокруг диска градиент концентрации антибиотика с формированием зоны задержки роста, размер которой зависит от чувствительности бактерии и свойств антибиотика. Содержание пре­парата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений минимальных подавляющих концентраций для патоген­ных бактерий. Исследуемую бактериальную культуру, суспендированную в физиологическом растворе, засе­вают газоном в чашки Петри на специальные питательные среды (Мюллера-Хинтон или АГВ, не препятст­вующих диффузии антимикробных веществ и не оказывающих на них отрицательного действия), на поверхность которых накладывают диски с антибиотиками. Посевы инкубируют 18—20 ч при 37⁰ С. Учет резуль­татов осуществляют путем измерения диаметра зоны полной задержки роста. Вывод о чувствитель­ности бактерий к антибиотикам осуществляют с учетом специально разработанных критериев (таблица 6).

8. Количественное определение чувствительности бактерий к ан­тимикробным препаратам с помощью Е-теста. Е-тест является вариантом диффузионного метода, позволяющим оп­ределять МПК антибиотика. Для этого вместо индикаторных дисков с антибиотиками используют особые полимерные полоски, содержащие иммобилизован­ные антимикробные препараты в виде непрерыв­ного градиента концентраций от 0,016 до 256 мкг/мл. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении по­лоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствую­щего шкале. После инкубации посева вокруг полоски образу­ется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные кри­терии.

Таблица 6

Интерпретация значений диаметров зон задержки роста при определении чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (среда АГВ)