Молекулярно-генетические методы идентификации микроорганизмов

Эти методыосновываются на анализе нуклеиновых кислот микроорганизмов.

1. Рестрикционный анализ. Сущность метода заключается в обработке ДНК рестрикционными ферментами (специфическими эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. После этого анализируют полученные фрагменты, специфические для каждого вида или варианта микроорганизма.

2. Гибридизация ДНК. Метод основан на определении уникальных последовательностей генома микроорганизма, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. Исследование проводят с помощью меченых ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновых зондов, представляющих однонитевые фрагменты ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Основной областью применения является идентификация трудно культивируемых или медленно растущих микробов (например, представителей родов Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter ). Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР позволяет обнаруживать уникальные (специфические) участки ДНК, находящиеся в исследуемом образце в очень малых количествах. Сущность ПЦР основана на амплификации (увеличении) числа копий искомого участка генома микроорганизма, причем для идентификации вида микроорганизма теоретически достаточно одной копии искомой уникальной последовательности. С этой целью образец инкубируют в буферном растворе с двумя короткими ДНК-олигомерами (праймерами), комплементарными концам известного уникального фрагмента генома, термостабильной ДНК-полимеразой и нуклеотидами. После гибридизации олигомеров с комплементарными участками ДНК они служат праймерами для полимеразы, которая копирует искомый фрагмент. Образец многократно (20-40 раз) нагревают для разделения цепей двойной спирали ДНК и охлаждают для повторной гибридизации праймеров с комплементарной матрицей, при этом каждая копия участка ДНК становится новой матрицей для синтеза следующей копии. Количество копий искомого фрагмента генома в результате амплификации в специальном приборе – амплификаторе (рис. 27, см. приложение) экспоненциально увеличивается. Амплификация в миллионы раз занимает всего несколько часов. Определение амплифицированной ДНК осуществляется либо электрофорезом в геле с помощью специального оборудования (рис. 28, см. приложение) с последующим окрашиванием пробы флюоресцентным красителем и регистрацией результатов электрофореза в приборе – трансиллюминаторе (рис. 29, см. приложение), либо флюориметрическим методом (в этом случае зонды и/или праймеры имеют флюоресцентную метку, которая учитывается на приборе- флюориметре – рис 30, см. приложение).

ПЦР широко используется в диагностических целях. Достоинства ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний заключаются в следующем:

1. ПЦР дает прямые указания на присутствие возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры.

2. Метод обладает очень высокой чувствительностью (от нескольких до одного возбудителя в пробе) и 100% специфичностью. Количество исследуемого материала может составлять несколько десятков микролитров.

3. Исследуемый материал может быть дезинфицирован с помощью химических или термических методов, что исключает инфицирование персонала в процессе проведения ПЦР.

1. Простота исполнения, возможность полной автоматизации, быстрота получения результатов (4-5 часов) позволяет отнести ПЦР к экспресс-методам диагностики.