3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра.
Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий).
Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 108 бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО4 и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона и инкубируют при 370 С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 102—105 по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.
Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.
На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные колонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концентрацией антибиотика, являются к нему резистентными. Параллельно делают контрольные посевы.
4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм кишечной палочки - Escherichia coli Strs, донором - ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Strr , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл).
К 1 мл бульонной культуры E.coli добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 370 С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10–5 – 10-6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля - на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 370 С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма .
Опыт специфической трансдукции (демонстрация). Реципиентом является штамм Е. coli lac-, лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного - красные колонии с металлическим блеском.
К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 106—107 бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 370 С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 106 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.
6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu+ Strs. Реципиент—штамм E. coli K12F- leu- Strr. Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 370 С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10–2 - 10-3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают штаммы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селективную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 370 С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.
7. Учет ПЦР при уреаплазмозе (демонстрация, рис. 31).
| Клиническая проба | Отрицательная проба | Mycoplasma genitalis | Ureaplasma urealyticum | Mycoplasma hominis | Длина нуклеотидных пар |
| |||||
| 
| ||||
| |||||
| Рис. 31. Разделение в агарозном геле продуктов амплификации фрагментов генов микоплазм.0 –длина нуклеотидных пар, 1 – Mycoplasma hominis – положительный контроль, 2 – Ureaplasma urealyticum – положительный контроль, 3 Mycoplasma genitalis –– положительный контроль, 4 ––отрицательный контроль, 5 – клиническая проба, положительная на Ureaplasma urealyticum |
