I. Микрофлора кожи (окончание). а) Изучение характера роста микробов на среде Кесслера. Приготовление мазка со среды Кесслера и окраска его по Граму. б) Учет характера роста на чашках со средой Левина (посев мазков-отпечатков кожи пальцев был произведен на предыдущем занятии). Сделать вывод о качественном составе микрофлоры кожи рук.
2. Микрофлора воздуха изучается обычно с помощью аспирационного метода. Исследуемый воздух просасывается через аппарат Кротова. Для определения общего количества микробов скорость просасывания должна быть 25 л/мин длительность экспозиции 4-5 мин.; для обнаружения кокков используется кровяной МПА, длительность экспозиции - 10 - 15 мин. Количество выросших колоний пересчитывают на 1м3 воздуха. Нормативы микробной обсемененности воздуха больничных помещений отражены в таблице 7.
3. Микрофлора воды (демонстрация). Критерии оценки санитарного состояния водопроводной воды:
а) определение общего микробного числа водопроводной воды. Произведен посев 1 мл воды на чашку с MПА. Подсчитывается количество выросших колоний - микробное число воды. В 1 мл водопроводной воды допускается не более 50 микроорганизмов;
Таблица 7.
Показатели микробной обсемененности воздуха в больничных помещениях
| Место отбора проб | Микробное число | Содержание S.aureus |
| Операционные До начала работы Во время работы | Не более 500 | Не допускается |
| Не более 1000 | Не допускается | |
| Не более 1000 | Не допускается | |
| Родильные комнаты | Не более 1000 | Не допускается |
| Палаты для недоношенных детей | Не более 750 | Не допускается |
б) определение, коли-титра и коли-индекса водопроводной воды бродильным мeтодом (демонстрация). Водопроводная вода в количестве 333 мл (3 объема по 100,0 мл; 3 объема по 10,0 мл; и 3 объема по I мл) засевается на глюкозо-пептонную среду. Посевы инкубируют в термостате при 37°С 24 часа. Из всех проб, где произошел рост с помутнением, кислото- и газообразованием, производят высев на чашки Петри со средой Эндо. Чашки инкубируют в термостате при 37°С 16-18 часов. Учет результатов производят по наличию типичных колоний (окрашенных в ярко-розовый цвет - лактозопозитивных), морфологии микроорганизмов в этих колониях (грамотрицательные палочки) и определению оксидазы путем посева колоний на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-парафенилдиамином. При отрицательном оксидазном тесте цвет бумаги не изменяется, при положительной она окрашивается в синий цвет в течение 1 мин. Бактерии родов Esherichia, Citrobacter, Enterobacter оксидазной активностью не обладают. Грам-отрицательные палочки, не образующие оксидазу, пересевают в полужидкий глюкозный питательный агар, инкубируют при 370 С в течение 18-24 часов. Расчет коли-индекса осуществляется по специальным таблицам (см. табл.8).
В) определение коли-индекса методом мембранных фильтров (демонстрация). Мембранный фильтр помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуум-насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Исследуемую воду фильтруют в объеме 500,0 мл. Затем фильтры помещают на поверхность среды Эндо в чашку Петри и после инкубации при 370С в течение суток подсчитывают количество колоний красного цвета. Колонии красного цвета переносят на фильтровальный диск, смоченный диметил-парафенилдиамином для определения оксидазной активности. При наличии оксидазы колонии окрашиваются в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие первоначальную окраску, пересевают в полужидкий глюкозный питательный агар, инкубируют при 370 С в течение 18-24 часов. При наличии газообразования подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс. Нормативы для питьевой воды - число микробов в 1 мл – не более 50 клеток, коли-индекс (количество кишечных палочек в 1 литре воды) - не более 2. Коли-титр - количество воды, в котором находится 1 кишечная палочка) – 500.
Таблица 8
Определение коли-индекса и коли-титра при исследовании воды
| Количество положительных результатов | Коли-индекс | Пределы индекса | Коли-титр | |||
| Из 3 объемов по 100 мл | Из 3 объемов по 10 мл | Из 3 объемов по 1 мл | Нижний | верхний | ||
| Менее 3 | - | - | Более 3300 | |||
| 0,5 | ||||||
| 0.5 | ||||||
| 0.5 | ||||||
| … | … | … | ||||
| … | … | … | … | … | … | … |
| 0,9 | ||||||
| Более 1100 | - | - | Менее 0,9 |
4. Микрофлора почвы (демонстрация).
а) Определение общего микробного числа почвы. Навеску почвы (30 г), вносят в колбу с водой объемом 270 мл, готовят разведения 10-3, 10-4, 10-5, смешивают по 0,1 мл указанных разведений суспензии почвы с 40 мл расплавленного и остуженного до 400С MПA, затем выливают вторым слоем в чашки Петри с 2% МПА. Посевы инкубируют при 370 С в течение 18-24 часов, после чего определяют количество выросших на чашке колоний;
б) Определение перфрингенс-титра почвы при посеве ее различных разведении на молоко или среду Вильсона-Блера (агар с глюкозой, хлоридом железа и сульфитом натрия). Учет результатов проводят по свертыванию молока или образованию черных колоний Cl. perfringens через 48 часов на среде Вильсона-Блера. Нормативы санитарного состояния почвы представлены в таблице 9. Демонстрацию описать, зарисовать.
Таблица 9
Санитарное состояние почвы по данным микробиологического исследования
| Характеристика почвы | Коли-титр | Перфрингенс-титр | Число термофильных бактерий в 1 г. почвы |
| Чистая Загрязненнная Сильно загрязненная | 1,0 и выше | 0,01 и выше | 102 - 103 |
| 0,9 – 0,01 | 0,009-0,0001 | От 103 – 105 | |
| 0,09 и ниже | 0,00009 и ниже | 105 – 4х106 |
в) Микрофлора пищевых продуктов (демонстрация). Качество санитарно-бактериологического состояния молока и молочных продуктов оценивается по присутствию мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАМ) и присутствию бактерий группы кишечной палочки (БГКП).
определение МАФАМ (демонстрация). Молоко разводят стерильным физиологическим раствором в разведениях 1:10,1:100, 1:1000. По 1,0 мл каждого разведения расплавленного и остуженного до 400С MПA засевают на дно чашки Петри с МПА, инкубируют при 370 С в течение 18-24 часов, затем подсчитывают количество выросших колоний.
- определение БГКП (демонстрация). Цельное пастеризованное молоко засевают в 6 пробирок со средой Кесслера (в 3 пробирки – по 1 мл, в остальные - по 0,1 мл). Посевы инкубируют при 430С в течение 1 суток, после чего из проросших сред делают посевы на среду Эндо и инкубируют при 370С в течение суток. Из выросших красных колоний готовят мазки в окраске по Граму, микроскопируют и делают посевы на среду Козера (дистиллированная вода, фосфат натрия-аммония, фосфат калия однозамещенного, сульфат магния, цитрат калия) и в пептонную воду с глюкозой, культивируя соответственно при 370С и 430С в течение 18-24 часов. Учет производят по расщеплению глюкозы с образованием кислоты и газа при отсутствии роста на цитратной среде Козера. Аналогично исследуют сливки, молочно-кислые продукты, мороженое.
Провести учет результатов демонстрационного опыта по определению МАФАМ и БГКП
Обнаружение патогенных бактерий (демонстрация). Произведен посев различных разведений молока на желточно-солевой агар, среду Левина, кровяной МПА. Определить наличие патогенных бактерий. Сделать вывод. Результаты записать.
Санитарно-бактериологическое исследование напитков (лимонад, минеральные воды) - демонстрация. Определяют микробное число и БГКП, используя при этом методы, применяемые для исследования питьевой воды. Перед проведением исследования лимонад нейтрализуют 10 % раствором гидрокарбоната натрия, проверяя реакцию среды с помощью лакмусового индикатора. Отобранные пробы минеральной воды выдерживают при 430 С в течение 1 ч для удаления избытка газа. Коли-титр определяют методом мембранных фильтров. С этой целью 500 мл напитка фильтруют через мембранные фильтры (100 мл через 1 фильтр), после чего последние промывают стерильной водой для удаления остатков минеральных солей и помещают на поверхность среды Эндо. Посевы инкубируют при 370 С, после чего определяют БГКП. Демонстрацию описать, зарисовать.
Санитарно-бактериологические нормативы для лимонада, кваса, фруктово-ягодных безалкогольных напитков и минеральных вод должны соответствовать нормативам питьевой водопроводной воды.
Санитарно-бактериологическое исследование мяса, колбасных изделий и мясных продуктов - демонстрация. Определяют количество бактерий в окрашенных по Граму мазках-отпечатках из кусочков мяса размером 2х1,5х2,5 см. Норматив для свежего мяса - не более 10 бактериальных клеток в поле зрения.
Бактериологическое исследование мяса и мясных продуктов включает определение количества МАФАМ, БГКП, сальмонелл, бактерий рода Proteus, коагулазоположительных стафилококков и клостридий. Анализ поверхностных и глубинных участков продукта проводят не позднее чем через 4 ч с момента отбора проб. При исследовании глубинных участков образцы продукта предварительно обрабатывают спиртом и обжигают. К навескам продукта массой 20 г добавляют 80 мл стерильного физиологического раствора и гомогенизируют в ступке или электрическом гомогенизаторе. Для определения общего количества микробов в 1 г продукта делают посев 0,1 и 0,01 г продукта на питательный агар методом пластинчатых разводок Коха, инкубируют 48 ч и подсчитывают число колоний. Для определения бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта производят посев 5 мл взвеси на элективно-дифференциальную среду Кесслера, инкубируют в течение 18—20 ч. с последующим пересевом на среду Эндо. Определение сальмонелл проводят в навеске продукта не менее 25 г. Делают посев разведения навески в 100 мл среды обогащения (селенитовый бульон и магниевая среда), инкубируют в течение 24 ч., после чего делают высев на висмут-сульфит агар
При наличии Proteus spp. наблюдается ползучий рост. В мазках выявляют грамотрицательные палочки, определяют их подвижность и идентифицируют культуру бактерий.
Для определения коагулазоположительных стафилококков проводят посев 0,2 мл взвеси продукта на желточно-солевой агар, инкубируют посевы при 370 С и при комнатной температуре. При обнаружении стафилококков проводят их идентификацию.
Для обнаружения анаэробных спорообразующих бактерий Clostridium perfringens делают посев 10-кратных разведении взвеси в сульфитциклосериновую среду (СЦС) и среду Вильсона—Блера. Посевы инкубируют при 460 С в течение 12 ч; при наличии C.perfringens наблюдается почернение среды. При положительном результате посева разведения 10 -1 считается, что в 1 г продукта содержится 10 клеток соответствующих бактерий; разведения 10 -2 — 100 клеток и т.д. Демонстрацию описать, зарисовать.
Колбасные изделия и продукты из мяса в соответствии с действующими нормативами не должны содержать бактерии группы кишечной палочки при исследовании 1 г продукта, сальмонелл в 25 г, бактерий рода Proteus и сульфитредуцирующих клостридий 0,1 г; микробное число не должно превышать 103.
Санитарно-бактериологическое исследование консервов - демонстрация. В консервах определяют наличие аэробных и анаэробных бактерий, при необходимости (по эпидемиологическим показаниям) - Clostridium botulinum и ботулинического токсина. Перед бактериологическим исследованием консервную банку проверяют на герметичность в сосуде с горячей водой, ставят контроль на бомбаж, выдерживая в термостате при 37 "С в течение 5 суток, после чего моют теплой водой, высушивают, протирают спиртом и обжигают верхнюю крышку смоченным спиртом горящим ватным тампоном. Содержимое банки засевают для выявления аэробной флоры в две пробирки с бульоном, а для обнаружения анаэробной микрофлоры — в две пробирки со средой Китта—Тароцци. Посевы инкубируют при 370 С в течение 5 суток. При наличии роста аэробные бактерии пересевают на питательный агар, среду Эндо, скошенный агар (по Шукевичу) и на питательный агар с 1 % глюкозы. Из среды Китта—Тароцци берут 1—2 мл, вносят в чашки Петри и заливают расплавленным и охлажденным до 45-480 С питательным агаром с 1 % глюкозы. После застывания на поверхность среды помещают стерильное предметное стекло (для создания анаэробных условий). Посевы инкубируют в течение 1 суток при 370 С. Из выросших колоний получают чистую культуру, которую затем идентифицируют по общепринятой схеме.
Для выявления ботулинического токсина исследуемые пробы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию нейтрализации токсина с антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, С, Е, F на белых мышах или обнаруживают присутствие токсина с помощью других серологических реакций (РНГА, иммуноферментный анализ). В консервах не допускается присутствия C.botulinum и его токсина, С.регfringens и других патогенных бактерий.
Присутствие аэробной неспорообразующей флоры указывает на недостаточную эффективность примененных методов консервирования и возможность порчи. Присутствие сапрофитных аэробных бацилл {B.subtilis, B.mesentericus) является допустимым при герметичности и отсутствии бомбажа консервных банок.
