Положительный результат - субстрат меняется от розового цвета к красному.
Отрицательный результат - субстрат остается янтарного цвета до 10 дня инкубации.
Предосторожности
Иногда в янтарной жидкости появляется красный осадок. Это положительная реакция нейтрального красного, но отрицательный тест на гидролиз Твина 80. Положительный гидролиз регистрируют, когда вся жидкая среда меняет цвет от бледно-розового до красного.
В редких случаях во время инкубирования супернатант белеет. В этом случае тестирование необходимо повторить. В случае повторного посветления регистрируют отрицательный результат.
Пиразинамидаза
Принцип метода. Тест основан на способности M tuberculosis в течение 4-х дней дезаминировать пиразинамид до пиразиновой кислоты и аммония, что указывает на наличие пиразинамидазы. Это исследование помогает такжеотличить M marinum (положительный результат до 4 дней) от M kansasii (отрицательный результат), и ниацин-положительные штаммы M. bovis от M. tuberculosis и M avium комплекс. У M. bovis пиразинамидаза отрицательна и на 7 день, тогда как M. tuberculosis и M avium комплекс дают положительный результат уже на 4 день. Тест применяется как дополнительный для дифференциации M. tuberculosis от M. bovis.
Реактивы
Среда для субстрата
Растворяют 6,5 г основы среды Дюбуа (Dubos) в 1 л дистиллированной воды. Добавляют 0,1 г пиразинамида (его можно заменить пиразиновой кислотой в том же количестве), 2,0 г пируват натрия, и 15,0 г агара. Подогревают до растворения агара и разливают в пробирки по 5 мл. Автоклавируют в течение 15 минут при 121°С. Остужают до застывания в вертикальном положении. Хранят в холодильнике в течение нескольких месяцев.
1% сульфат аммонийного железа
Готовят 1% раствор сульфата аммонийного железа сразу перед использованием: к 0,1 г сульфата аммонийного железа добавляют 10 мл дистиллированной воды.
Контроли
В качестве положительного контроля используют M. avium комплекс.
В качестве отрицательного контроля используют засеянную пробирку с M.bovis или M.kansasii.
Методика
Добавляют на поверхность среды двух пробирок полную лопатку 2-3 недельной культуры микобактерий, инкубируют при 37°C.
Через 4 дня добавляют 1,0 мл свежеприготовленного 1% раствора сульфата аммонийного железа к исследуемой культуре, контролю стандарта цвета, положительному и отрицательному контролям.
Оставляют пробирки на 30 минут при комнатной температуре, затем регистрируют покраснение среды. Среда приобретает розовый цвет, что свидетельствует о ферментативном гидролизе пиразинамида до свободной кислоты. Цвет в исследуемой пробирке легко определить на белом фоне при комнатном освещении.
Для минимизации контаминации нестерильного раствора сульфата аммонийного железа пробирки с отрицательным результатом помещают на 4 часа в холодильник и проверяют цвет среды (покраснение).
Если на четвертый день результат отрицательный или сомнительный, повторяют тестирование со второй пробиркой. Если результат положительный, то вторую пробирку можно сбросить.
Результаты и их интерпретация
Положительный результат - розовый цвет агара.
Отрицательный результат - цвет агара не меняется. 7.2.1.7. Уреаза
Принцип метода. Способность культуры гидролизировать мочевину (с высвобождением аммиака) используется для идентификации скотохромогенных и нефотохромогенных микобактерий.
M. scrofulaceum, M. szulgai, M. flavescens, M. bovis, M. tuberculosis, и M. gastri дают положительный результат, тогда как M. avium комплекс, M. xenopi, M. terrae комплекс, M. gordonae - отрицательны.
Дисковый метод
Приготовление реактивов
Помещают в пробирку с дистиллированной водой диск с уреазой.
Контроли
В качестве положительного контроля используют M. scrofulaceum или M.fortuitum. Отрицательным контролем служит незасеянная пробирка или уреаза-негативная M.gordonae.
Методика
В пробирку с субстратом вносят полную лопатку 3-недельной исследуемой культуры, выросшей на яичной среде, инкубируют при 37°C. Результат учитывают через 1 час и до 3 дней.
