Оценка и учет роста микобактерий

При выделении культуры кислотоустойчивых бактерий, характеризующейся следующими признаками:

- появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3-4 недель инкубации;

- наличие колоний характерной морфологии и окраски;

- кислотоустойчивость выделенного микроорганизма, подтвержденная микроскопически при окраске по Ziehl-Neelsen

следует произвести количественную оценку интенсивности роста, для чего регистрируют число КОЕ, выросших на каждой из пробирок с разными питательными средами.

Интенсивность роста оценивают по 3-х балльной системе:

(1+) – 1–20 КОЕ – скудное бактериовыделение;

(2+) – 21–100 КОЕ – умеренное бактериовыделение;

(3+) – > 100 КОЕ – обильное бактериовыделение.

Величина КОЕ высчитывается как среднее по результатам подсчета числа колоний, выросших на всех пробирках.

Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных.

 

7. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ

 

Род Mycobacterium - единственный представитель группы 21 «Микобактерии», согласно девятому изданию «Определителя бактерий Берджи». Род Mycobacterium представлен более чем 100 видами; в клиническом диагностическом материале обычно определяется 10–12 видов микобактерий.

Выделенная культура микобактерий должна быть идентифицирована на основании скорости роста, пигментообразования и результатов биохимических и культуральных исследований. Окончательная идентификация никогда не должна базироваться на единичных тестах или характеристиках, так как отдельные штаммы могут давать отклонения от ожидаемых результатов тестирования, присущих данному виду. Сочетание характерных признаков с результатами приводимых ниже биохимических и культуральных тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса M. tuberculosis с точностью до 95%.

Предварительная идентификация комплекса Mycobaterium tuberculosis

Первичная идентификация микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам:

– скорость роста на плотных питательных средах;

– пигментообразование;

– морфология колоний;

– наличие кислотоустойчивости;

– температура роста.

Характеристика колоний M. tuberculosis

Типичные культуры M.tuberculosis, выросшие на плотных питательных средах - восковидные, сухие, морщинистые, растут в виде R -колоний (от английского слова rough - грубый, шершавый), не пигментированы (кремового цвета или цвета слоновой кости). После курса химиотерапии от больных туберкулезом могут выделяться гладкие колонии с влажным ростом (S -формы (от английского слова smooth- гладкий)). Первичный рост при посеве патологического материала появляется на 21–60 день. Пассажные культуры растут быстрее – 10–21 день.

Морфология микобактерий

Колонии микобактерий туберкулеза не эмульгируются в изотоническом растворе, а образуют зернистую крошковидную суспензию. Это обусловлено наличием в составе их клеточной стенки большого количества гидрофобных жиро-восковых субстанций. При микроскопическом исследовании мазков из выросших колоний, окрашенных по Ziehl-Neelsen, обнаруживаются яркие малиново-красные палочковидные бактерии, лежащие одиночно или группами, образующие скопления или переплетения в виде «войлока» или «кос». Микобактерии туберкулеза выглядят как тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1–10 (чаще 1–4) мкм, шириной 0,2–0,6 мкм, гомогенные или зернистые с незначительно закругленными концами. Часто в препарате, особенно в длительно растущих культурах, видны скопления темно окрашенных зерен. В молодых культурах, особенно выделенных от больных, длительно леченных противотуберкулезными препаратами, микобактерии отличаются большим полиморфизмом, вплоть до появления коротких, почти кокковидных форм. Если морфология колоний или микобактерий вызывает сомнения в их принадлежности к роду Mycobacterium или культуры выделены из материала, который может содержать кислотоустойчивые сапрофиты (моча, гной из ушей и др.), мазки дополнительно обесцвечивают 3% солянокислым спиртом в течение 40–45 минут. Следует учитывать, что молодые культуры микобактерий туберкулеза могут сравнительно легко обесцвечиваться спиртом, так как они обладают слабой кислотоустойчивостью. В таких случаях культуры следует выдержать в термостате еще 5 -10 дней и вновь повторить микроскопическое исследование, чтобы убедиться в их тинкториальных свойствах.

При культуральном исследовании ответ о выделении кислотоустойчивых микобактерий дается только после микроскопии окрашенного по Ziehl-Neelsen мазка из выросших колоний.

Нетуберкулезные и авирулентные сапрофитные микобактерии могут варьировать по форме колоний и морфологии клеток.

Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерий туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании характерных признаков, подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу M. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным.

Продукция пигмента

Микобактерии, в зависимости от вида, синтезируют каротиноидые пигменты в различных количествах и разновидностях. В 50-х годах ХХ века Раньоном так называемые «атипичные» микобактерии по пигментообразованию и скорости роста были разделены на четыре группы. Несмотря на то, что микобактерии должны точно распознаваться по видовому имени, для облегчения точной идентификации отдельных изолятов или неизвестных микроорганизмов, предложено разделять атипичные микобактерии на фотохромогенные, скотохромогенные, нефотохромогенные и быстрорастущие.

Фотохромогенные микроорганизмы продуцируют пигмент только после экспозиции на свету. Колонии таких микобактерий обычно белые, кремовые, или темно-желтые, когда выращены в темноте и непигментированы до экспозиции на свету. M.kansasii – фотохромоген, становится ярко желтым после освещения. Напротив, некоторые штаммы M.simiae демонстрируют фотохромогенность только после длительных периодов освещения.

Скотохромогены – это микроорганизмы, продуцирующие пигмент в темноте или на свету. Например, M.gordonae и M. scrofulaceum. Продукцию пигмента можно усилить, если культуры подвергнуть непрерывному освещению (2 недели или более). M.szulgai демонстрирует уникальные свойства: будучи скотохромогенными при 37°C, при 25°C проявляют свойства фотохромогенности. По этой причине, все пигментированные культуры должны быть проверены на фотоактивизированный пигмент и при 37°C, и при 25°C.

Нефотохромогены - микроорганизмы, не продуцирующие пигмента. Редкие штаммы проявляют цвета от бледных пастелей до насыщенно-оранжевого.

Пигментообразование должно быть изучено на всех медленнорастущих культурах, которые не образуют пигмента в темноте, и на пигментированных культурах, которые не были выращены непрерывно в темноте.

Хотя быстрорастущие микобактерии легко определяются по скорости роста, но они также проявляют все вышеописанные варианты пигментов.

7.1.4. Определение продукции пигмента

Принцип метода - определение пигментообразования у выделенных атипичных микобактерий в темноте и на свету. Температурный режим испытания должен быть стандартизирован.

Методика

Суспензией тест–микроорганизма засевают пять пробирок с яичной средой. Четыре пробирки изолируют от света, обернув их алюминиевой фольгой или черной бумагой.

Инкубируют две защищенных от света культуры при 25°C, две защищенных от света культуры и одну незащищенную культуру - при 37°C до появления роста в незащищенной от света пробирке. Иногда могут быть использованы другие температуры для инкубации (например, при подозрении на M. marinum или М. xenopi)

Удаляют защитный экран с одной пробирки каждого температурного режима и, при наличии роста, регистрируют наличие пигмента. Культуры в защищенных от света пробирках (каждого температурного режима) являются контролем фотоактивного пигментообразования.

Если исследуемая культура в пробирке (пробирках) не пигментирована, ее (их) подвергают 3–5 часовому освещению 60W вольфрамовой лампочки (или эквивалентной люминесцентной лампочки) на расстоянии 20–25 см от культуры. При экспозиции крышки пробирок должны быть обязательно закрыты.

Если культура, выросшая при 37°C, пигментирована, обращают внимание на пигмент при 25°C (M szulgai может быть фотохромогенна при 25°C, скотохромогенна при 37°C).

После световой экспозиции пробирки закрывают бумагой (фольгой), реинкубируют все культуры при разных температурных режимах и просматривают их после 24, 48 и 78 часов. Сравнивают освещенные культуры с защищенными от света культурами.

Примечание: фотоактивный пигмент может проявиться медленнее при культивировании при 25°C, чем при 37°C.