Реактивы для нанесения на бумажные полоски:
Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)
В пробирку с 1,75 мл 96° этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК. Смесь подогревают на водяной бане при 56°С в течение 5–10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.
Раствор 2. 60% раствор роданистого калия Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты (200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).
Раствор 3. 50% раствор хлорамина "Б" 3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56–60°С при периодическом встряхивании.
Индикаторные бумажные полоски готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими или автоматическими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:
− 20% раствор ПАСК – на отмеченный карандашом конец полоски;
− 60% раствор роданистого калия – на середину полоски;
− 50% горячий раствор хлорамина "Б" – на свободный конец полоски.
Между каплями должны оставаться сухие промежутки.
Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.
Методика
Добавляют в пробирку с исследуемой культурой 1,0 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия или дистиллированной воды. Кладут пробирку горизонтально, чтобы жидкость покрыла всю поверхность питательной среды, оставляют на 30 минут для экстракции ниацина. Время экстракции может быть увеличено, если колоний слишком мало.
Пробирки ставят в вертикальное положение на 5 минут, чтобы вода полностью стекла на дно. Переносят 0,5 мл экстракта в чистую пробирку с завинчивающейся крышкой.
Индикаторную полоску помеченным карандашом концом (на который нанесен ПАСК), опускают с помощью пинцета в пробирку с экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью средней части полоски, оставляют при комнатной температуре на 15—30 минут. Допустимо слегка встряхивать пробирку, но не переворачивать ее.
Наблюдают появление желтого окрашивания на дне пробирки на белом фоне. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как ее появление может быть вызвано окислением реактивов в верхней части полоски.
Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.
Результаты и их интерпретация
Положительный результат - экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности. Отрицательный результат - нет окрашивания жидкости.
Нитратредуктазный тест
Принцип метода заключается в определении активности нитратредуктазы по количеству восстановленного нитрита из нитрата, что сопровождается цветной реакцией с парадиметиламинобензальдегидом. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых нетуберкулезных микобактерий, у которых этот фермент отсутствует. Из всех микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у M. tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики M. tuberculosis и микобактерий других видов. Для определения способности микобактерий редуцировать нитраты используют 4-х недельные культуры с обильным ростом, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена.
Классический метод
Приготовление реактивов:
Раствор 1. Нитрат натрия в фосфатном буфере.
0,01 М раствор нитрата натрия в 0,022 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0) готовят следующим образом:
А. 3,02 г КН2РО4 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды;
Б. 3,16 г Na2НРО4 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды;
В. 611 мл раствора Б добавляю к 389 мл раствора А, хорошо смешивают (рН раствора 7,0).
В 1000 мл полученного буферного раствора (В) растворяют 0,85 г NaNО3.
Разливают полученный раствор 1 в емкости по 100 мл. Стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. При необходимости этот раствор можно переносить по 2 мл в пробирки с завинчивающимися крышками.
Раствор 2. Раствор соляной кислоты
Концентрированная соляная кислота - 10 мл
Дистиллированная вода - 10 мл
Медленно вливают концентрированную соляную кислоту в дистиллированную воду, чтобы получить разведение 1:1. Никогда не вливайте воду в кислоту!
Полученную смесь хранят в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.
Раствор 3. Раствор сульфаниламида (0,2%).
Сульфаниламид - 0,2 г
Дистиллированная вода - 100 мл
Растворяют сульфаниламид в дистиллированной воде. Полученную смесь хранят в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.
Раствор 4. Раствор N-нафтилэтилендиамина (0,1%).
N -нафтилэтилендиамин - 0,1 г
Дистиллированная вода - 100 мл
Растворяют нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде. Полученную смесь хранят в герметически закрытой бутыли из темного стекла в холодильнике.
Контроль реактивов
Перед выполнением теста необходимо проконтролировать пригодность реактивов:
отрицательный контроль – тест с экстрактом из пробирки с незасеянной средой;
положительный контроль – тест с экстрактом референс-штамма M. tuberculosis H37Rv.
Методика
0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия вносят в пробирку с завинчивающейся крышкой. С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендируют в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий (две лопатки биомассы бактерий).
Добавляют 2 мл раствора 1 (раствор нитрата натрия в буфере), хорошо встряхивают и оставляют на 3 часа в водяной бане при температуре 37°С.
Добавляют в следующем порядке:
1 каплю разведенной соляной кислоты (раствор 2), хорошо встряхивают пробирку;
2 капли 0,2% раствора сульфаниламида (раствор 3);
2 капли 0,1% раствора N-нафтилэтилендиамина (раствор 4);
Немедленно контролируют появление розового или красного окрашивания, сравнивая его интенсивность с цветовым стандартом.
