Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты, рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы. Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности окраски – от "+/–" до "5+" (см. выше). Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста.
Реагенты
Растворы:
1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na2HPO4 на 1000 мл воды)
2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г КН2PO4 на 1000 мл воды)
3. 0,067 М раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г Na3PO4 •12 Н2О на 1000 мл воды)
4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)
5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)
6. 0,01% раствор бромтимолового синего: 1,0 мл 1% раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.
Рабочий буферный раствор: Смешивают 35 мл раствора №1, 5 мл раствора №2 и 100 мл раствора №3.
Методика
В штатив ставят 8 чистых пробирок (пробирки №№ 1 -8).
Вносят 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с №2 до №8).
К 10 мл рабочего буферного раствора добавляют 0,1 мл раствора №4 и 0,2 мл раствора №6.
Вносят 2 мл раствора №7 в пробирку №1. Это цветовой стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности ("5+").
В пробирку №2 вносят 2 мл раствора №7, хорошо перемешивают и переносят 2 мл в следующую пробирку (№3).
Продолжают серию двукратных разведений вплоть до пробирки №8, из которой выливают 2 мл смеси.
В результате будут получены следующие цветовые стандарты:
пробирка №1 – 5+
пробирка №2 – 4+
пробирка №3 – 3+
пробирка №5 – 2+
пробирка №6 – 1+
пробирка №8 – +/-
Пробирки автоклавируют, закрывают их герметично и хранят при 5°С.
Каталазный тест
Принцип метода. Каталаза – это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2Н2О2 = 2Н2О + О2. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением M. bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов M. tuberculosis.
В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы, различающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют термостабильную каталазу.
При изучении каталазной активности микобактерий используют как качественные, так и количественные тесты:
- качественный (капельный) тест, указывающий на наличие каталазы (выполняется при комнатной температуре);
- полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);
- тест на термостабильность каталазы – тест определения наличия каталазы при 68°С и рН 7,0.
Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы M. tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой можно определить капельным методом. При постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм. После прогревания бактерий при 68°С и рН 7,0 в течение 20 минут микобактерии комплекса M. tuberculosis дают отрицательный результат.
Для постановки каталазных тестов следует использовать двухнедельные культуры, выращенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35–37°С. Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении. При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты пробками. Продолжительность инкубации - 14 дней.
Реактивы
0,067 М фосфатный буферный раствор, pH 7,0
Раствор1: Растворяют навеску Na2НРО4 9,47 г в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы получить 0,067 М раствор.
Раствор 2: Растворяют навеску КН2РО4 9,07 г в 1000 мл дистиллированной воды, чтобы получить 0,067 М раствор.
Для получения 0,067 М фосфатного буфера смешивают 611 мл раствора 1 и 389 мл раствора 2.
Перекись водорода, 30%
При постановке теста используют 30% раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно получают из аптек. 30% раствор перекиси водорода (Н2О2) хранят в холодильнике.
При работе с раствором используют резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.
Твин 80, 10%
Смешивают 10 мл Твин 80 с 90 мл дистиллированной воды и автоклавируют при 121°С в течение 10 минут. В процессе автоклавирования Твин 80 может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Готовый раствор хранят в холодильнике.
Готовый каталазный реагент (смесь Твина 80 с перекисью водорода)
Непосредственно перед постановкой теста смешивают равные объемы 10% раствора Твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.
Контроли:
Капельный метод
В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля - пробирку с референс-штаммом M. tuberculosis H37Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.
Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы при 68°С
В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля – пробирку с референс-штаммом M. terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.
Методика:
Капельный метод
Для постановки теста используют двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена. В пробирку с ростом микобактерий добавляют 1–2 капли свежеприготовленной смеси Твина 80 с перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдают в течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.
Результаты и их интерпретация:
Отрицательный результат - пузырьки газа не образуются
Положительный (медленный) результат - небольшое количество медленно образующихся пузырьков газа
Положительный (быстрый) результат - немедленное образование большого количества пузырьков газа
Полуколичественный метод
Для постановки теста используют двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена. В пробирку с ростом микобактерий добавляют 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью водорода, плотно закрывают пробирку и оставляют на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.
Измеряют высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены
Результаты и их интерпретация:
Каталазная активность слабая или отсутствует - высота столбика пены менее 31 мм
Неопределенный результат - высота столбика пены от 31 мм до 45 мм
Высокая каталазная активность - высота столбика пены более 45 мм
7.2.1.4. Тест на термостабильность каталазы при 68°С и рН 7,0
Методика:
С помощью стерильной пипетки вносят с соблюдением правил асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0) в пробирку размерами 16х125 мм с завинчивающейся крышкой. С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендируют в этом растворе исследуемую культуру микобактерий (использовать несколько петель биомассы).
Пробирки с бактериальными суспензиями помещают в предварительно нагретую водяную баню на 20 минут при температуре 68°С; температура и продолжительность инкубации имеют чрезвычайно важное значение.
Достают пробирки из водяной бани и оставляют при комнатной температуре до полного остывания.
Вносят в каждую пробирку 0,5 мл свежеприготовленной смеси Твина 80 с перекисью водорода и плотно закрывают пробки. Наблюдают за образованием пузырьков, появляющихся на поверхности жидкости. Нельзя встряхивать пробирку, так как при этом Твин 80 спонтанно образовывает пузырьки, что может стать причиной ложноположительного результата.
Пробирки с отрицательными результатами нельзя сбрасывать раньше, чем через 20 минут.
Результаты и их интерпретация:
Положительный результат - пузырьки газа образуются
Отрицательный результат - пузырьков газа нет
В редких случаях может наблюдаться небольшое количество пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты каталазного теста также считают положительными.
Гидролиз Твин 80
Принцип метода. Ферментативный гидролиз Твин 80 используется для определения потенциально патогенных видов (негативная реакция) от медленнорастущих скотохромогенных и нефотохромогенных сапрофитов (положительная реакция). Среда для исследования включает в себя Твин 80 и индикатор нейтральный красный (pH 7). В обычных условиях при pH 7 нейтральный красный красного цвета, но когда он связывается с липидами или Твин 80, индикатор становится янтарного или соломенного цвета, что показывает сдвиг pH в щелочную сторону. При энзимном гидролизе Твин 80 происходит освобождение нейтрального красного, и окраска восстанавливается от розовой до красной.
Реактивы
Фосфатный буфер, pH 7
a) Na2HPO4, 0067 М
Растворяют 9,47 г Na2HPO4 безводного в 1 л дистиллированной воды.
b) KH2PO4, 0,067 М
Растворяют 9,07 г KH2PO4 в 1 л дистиллированной воды.
Для приготовления 100 мл буферного раствора к 61,1 мл раствора «а» добавляют 38,9 мл раствора «b» и проверяют pH полученного раствора.
Субстрат среды
К 100 мл фосфатного буфера добавляют 0,5 мл Твин 80 и 2 мл 0,1 % водного раствора нейтрального красного. Полученный субстрат разливают в пробирки по 2 мл. Автоклавируют 10 минут при 121°C. После автоклавирования субстрат должен быть янтарного или соломенного цвета. Хранят в темном месте при 5°C не более 2 недель.
Контроли
Положительным контролем служит пробирка, засеянная M. kansasii.
Отрицательным контролем служит пробирка, засеянная M. bovis (BCG) или M. avium комплекс. В качестве отрицательного контроля можно использовать незасеянный субстрат.
Методика
Полную лопатку исследуемых микроорганизмов инокулировать в субстрат, инкубируют при 37°C.
Результаты учитывают на 1, 5 и 10 дни инкубирования. Регистрируют, на какой день цвет поменялся на розовый или красный. Не трясти пробирки при просмотре.
