| Показання манометра, МПа | Температура насиченої пари, °С | Показання манометра, МПа | Температура насиченої пари, °С |
| 0,15 | |||
| 0,05 | 0,2 | ||
| 0,1 | 0,3 |
Автоклав працює при високому тиску і температурі, і до його обслуговування допускаються тільки спеціально підготовлені особи, що мають посвідчення. При роботі з автоклавом строго дотримують правил, зазначених у доданій до апарата інструкції. Підготовку автоклава до роботи і процес стерилізації здійснюють у такий спосіб. Ретельно перевіряють справність апарата. У водопровідну камеру через лійку заливають здистильовану воду до верхньої мітки водомірного скла. Після цього кран перекривають. Поживні середовища у пробірках або колбах, закривають ватяними пробками з паперовими ковпачками, загорнений у папір посуд і інший стерилізований матеріал поміщають на ґратчасту підставку і накривають папером. Автоклав закривають кришкою, рівномірно загвинчують затиски, не допускаючи перекосів і неущільнень. Відкривають спускний кран паровідвідної труби, включають автоклав в електричну мережу і починають прогрівання. Пара, що утворюється, має витиснути з автоклава все повітря, тому що температура насиченої пари вище температури суміші пари з повітрям. Після повного видалення повітря і вологої пари безперервний струмінь свистячої пари випускають 10 – 15 хв і перекривають спускний кран. Пару випускають через гумовий шланг, надягнутий на паровідвідну трубу й опущений у судину з водою. За підвищенням робочого тиску в автоклаві стежать за манометром. Стерилізація починається з установлення потрібного тиску.
Зайва пара, що утворюється в результаті нагрівання, випускається запобіжним клапаном, якщо стрілка манометра переходить риску потрібного тиску. Після закінчення стерилізації автоклав виключають з електричної мережі, нагрівання припиняють і чекають, коли тиск на манометрі впаде до нуля. Тільки після цього можна відкрити спускний кран, обережно випустити з автоклава залишок пари, потім відгвинтити і відкинути кришку. Якщо спускний кран відкрити раніш, ніж стрілка займе нульове положення, може відбутися бурхливе скипання рідких середовищ і змочування ватяних пробок. Різке зниження тиску може призвести до виштовхування пробок і навіть вихлюпування рідини із посудин. Не можна передчасно відгвинчувати і відкривати кришку, тому що струмені пари, що вириваються, можуть спричинити опіки обслуговуючого персоналу і навколишніх. Автоклавові дають трохи охолонути і виймають простерилізований матеріал. Залишати автоклав закритим до повного охолодження не рекомендується, тому що пара конденсується, і волога просочує ватяні пробки. У неробочому стані автоклав тримають відкритим і вільним від води. Для перевірки стерильності поживні середовища ставлять на 2 – 3 доби в термостат при температурі 30 °С, якщо відбувається ріст мікроорганізмів, середовища готують заново.
Температура і тривалість автоклавування визначаються складом поживних середовищ та їх рН. Субстрати, що легко руйнуються у процесі нагрівання, стерилізують при температурі 120 ° С (тиск в автоклаві 0,05 МПа) впродовж 20 – 30 хв. При кислій реакції деякі речовини, що входять до складу поживного середовища, в процесі автоклавування гідролізуються. Щоб уникнути цих явищ розчини деяких компонентів (цукру, багатоатомні спирти, вітаміни, амінокислоти) стерилізують окремо при значеннях рН, що забезпечують їх стійкість, і додають у середовища після стерилізації. Такий спосіб знищення мікроорганізмів називається роздільною стерилізацією.
Стерилізація текучою парою – використовується для знеплідненняпоживних середовищ, які змінюють свій склад і властивості при температурі понад 100 °С. Суть її полягає в нагріванні поживного середовища при температурі 100 °С тричі по 30 хв протягом трьох діб. Короткочасне прогрівання середовища кип’ятінням знищує вегетативні клітини мікроорганізмів. Витримування середовищ протягом доби при кімнатній температурі або в термостаті при температурі 30 ° С дає змогу прорости життєздатним спорам. Вегетативні клітини, які утворюються з термостійких спор, гинуть при повторному кип’ятінні.
Дробову стерилізацію поживних середовищ проводять в апараті Коха або в автоклаві з закритою, але незагвинченою кришкою. Тому що нагрівання ведуть у парах киплячої води, спосіб називають стерилізацією текучою парою. Дробовій стерилізації піддають середовища, до складу яких входять цукри, багатоатомні спирти, желатин.
Стерилізація шляхом переривчастого нагрівання була запропонована англійським фізиком Джоном Тиндалем і одержала назву тиндалізації. Середовища, що необернено змінюються при кип’ятінні, обережно прогрівають при нижчій температурі: при 60 – 80 °С – впродовж 5 діб підряд по 30 – 60 хв або при 56 – 58 °С – впродовж 6– 7 діб, у першу добу – 2 год, у наступні – по 1 год. Температурну обробку середовищ ведуть у водяній бані або в ультратермостаті, де температура автоматично підтримується на визначеному рівні за допомогою спеціального пристрою. У проміжках між нагрівами середовища витримують у звичайному термостаті при 30 °С.
Пастеризація, або неповна стерилізація – призначена для знищення переважно аспорогенних мікроорганізмів одноразовим прогріванням при температурі 60 – 75 °С впродовж 20 – 30 хв або при температурі 80 °С впродовж 10 – 15хв. Пастеризації підлягають продукти і середовища, які під дією більш високих температур зазнають глибоких змін, втрачають якості та поживну цінність.
Стерилізація фільтруванням, або холодна стерилізація. Стерилізацію рідких поживних середовищ, які не витримують навіть незначного нагрівання, проводять за допомогою спеціальних дрібнопористих бактеріальних фільтрів (азбестових фільтрів Зейтца, мембранних нітроцелюлозних фільтрів і керамічних свічок). На бактеріальних фільтрах затримуються механічні зважені домішки, у тому числі і клітини мікроорганізмів. Винятки становлять віруси і фаги. Фільтруванню піддають середовища з білками, антибіотиками, вітамінами, леткими речовинами, культуральні рідини з метою звільнення від клітин і збереження всіх продуктів метаболізму в незмінному вигляді. Фільтри виготовляють з позитивно заряджених матеріалів. Тому на стінках фільтрів виникає відповідний позитивний заряд. Унаслідок того, що більшість мікроорганізмів у водних розчинах несе на поверхні негативний заряд, при фільтрації має місце не тільки механічна затримка клітин, але й їх адсорбція.
Стерилізація скляного посуду. Скляний посуд стерилізують сухим жаром у сушильній шафі при температурі 165 – 170 °С впродовж 1,5 – 2 год або шляхом автоклавування. Посуд перед стерилізацією ретельно миють і висушують. Пробірки і колби закривають ватяними пробками. Пробірки загортають по 10 – 20 – 40 шт. у папір. На колби надягають паперові ковпачки, що охороняють горло від пилу. На кінцях піпеток, що беруть у рот, вставляють ватяні тампони. Піпетки загортають у довгі смужки паперу шириною 4 – 5 см і поміщають у спеціальні металеві або картонні пенали з кришкою. При роботі піпетки виймають з пакета тільки за верхній кінець, де вставлений тампон. Чашки Петрі загортають у папір кожну окремо або по 2 – 3 шт.
Підготовлений посуд розміщають на ґратчастих полках у сушильній шафі або завантажують в автоклав, але не занадто щільно, щоб забезпечити циркуляцію гарячого повітря або сухої насиченої пари і рівномірне нагрівання посуду. Сушильна шафа має бути щільно закритою. Якщо шафа не оснащена терморегулятором, необхідно постійно стежити за температурою. Підвищувати температуру більш ніж 175 °С не варто, тому що папір і пробки починають руйнуватися. Щоб охоронити посуд від розтріскування, після закінчення стерилізації сушильну шафу охолоджують до 100 °С. і тоді посуд можна виймати. Для збереження стерильності посуд розгортають безпосередньо перед роботою.
Стерилізація інструментів і приладів. Для стерилізації дрібних металевих інструментів (петлі, голки, ланцети, пінцети, ножиці) застосовують прожарювання в полум’ї пальника або спиртівки (фламбування) безпосередньо перед використанням. На полум’ї недовго обпалюють горлечка пробірок, колб, пляшок, а також ватяні пробки при пересіванні культур і розливі середовищ. У полум’ї гинуть вегетативні клітини і спори мікроорганізмів.
Прилади для культивування мікроорганізмів, деталі до цих приладів, гумові пробки, з’єднувальні шланги стерилізують автоклавуванням, попередньо загорнувши в щільний папір. Чисті центрифужні пробірки, виготовлені з термолабільних пластмас, стерилізують ультрафіолетовим опроміненням (тривалість обробки встановлюють експериментально) і зберігають у стерильному посуді.
Для роботи у мікробіологічній лабораторії також використовують пластиковий одноразовий посуд, який стерильно упакований і придатний для розливу стерильного середовища та вирощування мікроорганізмів.
Завдання на виконання
1. Приготувати препарати “роздавлена крапля” бактерій: Micrococcus albus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Clostridium butyricum, промікроскопіювати (х40) та ознайомитись з морфологією. Звернути увагу на характер руху, форму і з’єднання клітин, характер спороутворення, місцезнаходження спор у клітинах бацил. Деякі бактерії приготувати у вигляді мазків, висушити, зафіксувати, зафарбувати розбавленим фуксином і розглянути з імерсією (х90).
2. Приготувати фіксований препарат молочнокислих продуктів (сметани, ряжанки чи закваски), розглянути з імерсією (х90) Lactococcus lactis та зарисувати.
3. Зафарбувати за Грамом бактерії Escherichia coli, Sarcina flava та Bacillus subtilis.
4. Виявити капсули у бактерій Leuconostoc mezenteroides або Azotobacter chroococcum.
Опрацювання результатів
1. Після ознайомлення з морфологією кожного виду бактерій необхідно виконати рисунки у робочому зошиті (рис. 7) підписи рисунків повинні містити родову та видову назви досліджуваних культур на латині.
2. Зарисувати ланцюжки клітин Lactococcus lactis при мікроскопіюванні фіксованих препаратів молочнокислих продуктів.
3. Зарисувати зафарбовані за Грамом бактерії (відмітити на рисунку приналежність: Гр+ чи Гр-)
4. Скласти таблицю морфологічних ознак розглянутих бактерій (табл.3.).
5. Вивчити і описати культуральні ознаки колоній бактерій на щільному поживному середовищі.
Таблиця 3.
| Вид бакте-рії | Форма клітин | Розмір клітин | Характер з’єднання клітин | Рухливість клітин | Наяв-ність спор | Забарв-лення за Грамом | Наяв-ність капсул | Став-лення до О2 |
Контрольні запитання
1. Форма бактеріальних клітин.
2. Як розмножуються бактерії?
3. Яка будова органів руху бактерій і яке значення має здатність до переміщення?
4. Які бувають спори у бактерій, коли вони утворюються, як вони розташовані в клітині? Чи є у бактерій статевий спосіб розмноження?
5. Основні морфологічні групи коків.
6. Значення кокових бактерій для харчової промисловості.
7. Бактерії, що утворюють капсули, їх значення.
8. Які паличкоподібні форми називають бактеріями, які – бацилами?
9. Роль молочнокислих і оцтових бактерій у харчовій промисловості.
10. Основні спорогенні бактерії, що зустрічаються в харчових виробництвах, їх значення.
11. Як готують, сушать і фіксують мазки?
12. Що таке просте і складне фарбування бактерій?
13. Техніка фарбування бактерій за Грамом.
14. Що таке негативне забарвлення і коли його застосовують?
15. Як приготувати препарат ”висяча капля” для розглядання рухливості бактерій?
16. Для яких цілей використовують поживні середовища?
17. На які групи поділяються поживні середовища?
18. Використання елективних і диференційно-діагностичних середовищ.
19. Що таке агар і желатин?
20. Що таке стерилізація?
21. Охарактеризуйте умови стерилізації поживних середовищ.
22. За яких умов здійснюється стерилізація лабораторного посуду?
ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 4
